Bionatura
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Latin American Journal of Biotechnology and Life Sciences
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2021.06.03.6
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INVESTIGATION / RESEARCH
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Purificación parcial de péptidos del veneno de escorpión Hadruroides charcasus (Karsch, 1879) con actividad antimicrobiana.
Partial purification of peptides from the scorpion venom Hadruroides charcasus (Karsch, 1879) with antimicrobial activity.

Orlando Pérez-Delgado 1, Clara Andrea Rincon-Cortés 2, Nohora Angélica Vega-Castro 3, Edgar Antonio Reyes-Montaño 4, Marcela Gómez-Garzón 5,
Available from: http://dx.doi.org/10.21931/RB/2021.06.03.6

RESUMEN

Los venenos de muchas especies de escorpiones son fuentes ricas en componentes biológicamente activos, como los péptidos antimicrobianos, biomoléculas que aún no han sido estudiados del veneno de Hadruroides charcasus. El objetivo de este artículo es evaluar la actividad antimicrobiana de los péptidos parcialmente purificados del veneno del escorpión Hadruroides. asus. A partir de 15,46 mg de proteína total del veneno del escorpión H. charcasus se purificaron parcialmente sus péptidos por medio de cromatografía de filtración en gel empleando sephadex G-75, consecutivo a una cromatografía de intercambio iónico en CM-Sephadex C-25. El peso molecular estimado de los péptidos se determinó mediante electroforesis PAGE-SDS-Tris-Tricina al 15% y la evaluación de la actividad antibacteriana y antifúngica se empleó el método de microdilución y Kirby-Bauer con cepas de Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y Candida albicans ATCC 10231. En la cromatografía de filtración en gel se obtuvieron 5 fracciones, de lo cual, la fracción IV presentó una concentración mínima inhibitoria de 3,6 mg/mL en S. aureus ATCC 29213 y en C. albicans ATCC 10231. De la cromatografía de intercambio se obtuvieron 7 fracciones, destacando la fracción OPDIV-5 con péptidos de 4 kDa; 5 kDa; 5,5 kDa y 6,4 kDa que presentó actividad antimicrobiana frente S. aureus ATCC 29213, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, C. albicans ATCC 10231.El veneno del escorpión H. charcasus presenta péptidos de naturaleza catiónica con actividad antibacteriana y antifúngica, según su actividad en las cepas evaluadas.
Palabras clave. antibacteriano, antifúngico, cromatografía de filtración, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis, veneno de escorpión, péptidos.
ABSTRACT

Venoms of many scorpion species are rich sources of biologically active components, such as antimicrobial peptides, biomolecules that have not yet been studied from Hadruroides charcasus venom. The aim of this article is to evaluate the antimicrobial activity of partially purified peptides from the venom of the scorpion Hadruroides charcasus. asus.
From 15.46 mg of total protein from H. charcasus scorpion venom, its peptides were partially purified by gel filtration chromatography using sephadex G-75, followed by ion exchange chromatography on CM-Sephadex C-25. The estimated molecular weight of the peptides was determined by 15% PAGE-SDS-Tris-Tricine electrophoresis and the evaluation of antibacterial and antifungal activity used the microdilution and Kirby-Bauer method with strains of Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 and Candida albicans ATCC 10231. In gel filtration chromatography, 5 fractions were obtained, of which fraction IV showed a minimum inhibitory concentration of 3.6 mg/mL in S. aureus ATCC 29213 and C. albicans ATCC 10231. From the exchange chromatography, 7 fractions were obtained, highlighting the OPDIV-5 fraction with peptides of 4 kDa; 5 kDa; 5.5 kDa and 6.4 kDa that presented antimicrobial activity against S. aureus ATCC 29213, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, C. albicans ATCC 10231.H. charcasus scorpion venom presents peptides of cationic nature with antibacterial and antifungal activity, according to their activity in the evaluated strains.
Keywords. antibacterial, antifungal, filtration chromatography, ion exchange chromatography, electrophoresis, scorpion venom, peptides.
INTRODUCCIÓN

La resistencia a los antimicrobianos es un problema de salud mundial tanto en medicina humana como veterinaria donde los agentes antimicrobianos han sido ampliamente utilizados para tratar enfermedades bacterianas, por ejemplo, Escherichia coli es un microorganismo comensal común en personas y animales con ciertas cepas que son patógenas y se consideran excelentes indicadores de resistencia a los antimicrobianos 1.
También se conoce que Pseudomonas aeruginosa es una bacteria metabólicamente versátil que puede causar una amplia gama de infecciones oportunistas graves y a menudo muestran resistencia adaptativa, debido al estado de crecimiento de la bacteria en el paciente, incluida la capacidad del microorganismo para crecer como biopelícula y además que conducen a la mortalidad 2. Otro de los ejemplos son reportes de Staphylococcus aureus, que está relacionada con su capacidad para adquirir y diseminar determinantes resistentes a los antimicrobianos en la naturaleza. En un estudio donde fueron positivos para S. aureus por PCR, más del 50% mostraron resistencia fenotípica a la meticilina, como también resistencia registrada a ampicilina y penicilina en un 96,7%, rifampicina y clindamicina 80%, oxacilina 73,3% y eritromicina 70%. También S. aureus reveló susceptibilidad variable a imipenem 96,7%, levofloxacina 86,7%, cloranfenicol 83,3%, cefoxitina 76,7%, ciprofloxacina 66,7%, gentamicina 63,3%, tetraciclina y sulfametoxazol-trimetoprima 56,7 % y vancomicina con doxiciclina en un 50% 3. Por otro lado, pero casos relacionados a las bacterias, son las infecciones fúngicas, las cuales han aumentado significativamente, lo que contribuye a la morbilidad y la mortalidad, como es el caso de Candida albicans caracterizado como un patógeno oportunista, a pesar de las terapias antifúngicas, ha llegado a ser letal por el aumento de la resistencia antimicrobiana, con una resistencia significativa frente a fluconazol e itraconazol a diferencia de otros antifúngicos que se reporta sensibilidad tales como para ketoconazol y anfotericina B 4.
Razones en las que actualmente se ha identificado un mecanismo intrínseco y la adquisición de resistencia antimicrobiana en muchas cepas bacterianas que son de gran importancia clínica por tal motivo ha puesto en grave peligro el uso de antibióticos y también ha provocado la propagación de microbios que son resistentes a los medicamentos efectivos de primera elección 5, Tal es así que la bacterias tanto gram positivas como gram negativas han logrado esta resistencia gracias a elementos genéticos móviles capaces de insertarse y transferirse de bacteria a bacteria. 6 Casos que han derivado el desarrollo de varios estudios experimentales, donde se ha logrado determinar que principios bioactivos tales como péptidos presentes en los venenos de escorpión logran desarrollar actividad antimicrobiana in vitro frente a diferentes microorganismos de importancia en el área de salud. Identificando actividades, independiente tanto de la especie de escorpión como del microorganismo evaluado. Uno de los reportes, es a partir del veneno del escorpión Tityus discrepans con una amplia actividad antibacteriana frente a bacterias Gram positivas y Gram negativas 7, mientras que los venenos de los escorpiones Urodacus yaschenkoi martensii 8 y Buthus martensii 9 y Androctonus amoeruxi son más efectivos  con bacterias Gram positivas, entre ellas S. aureus meticilino resistente (MRSA), siendo una cepa multidrogorresistente 10. Y el veneno de Vaejovis punctatus con actividad antifúngica 11. Características tomadas en cuenta para determinar si el veneno de H. charcasus posee efecto antimicrobiano sobre microorganismos de interés clínico, se planteó en el presente estudio cuyo objetivo es, evaluar la actividad antimicrobiana de péptidos aislados del veneno del escorpión H. charcasus frente E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 29213, P. aeruginosa ATCC 27853 y C. albicans ATCC 10231.
MATERIAL Y MÉTODOS

Escorpiones y veneno
Los especímenes de H. charcasus fueron recolectados en el distrito de Chongoyape, ubicado en la latitud 6º 37’ 40.0’’ y longitud 79º 25’ 21.4’’, Chiclayo (Perú), la identificación de la especie por el Dr. José Ochoa Cámara, de la Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco el veneno se obtuvo por estimulación eléctrica 12, luego se recolectó en tubos eppendorf, se liofilizó y se conservó a -20 °C hasta su uso, de 60 escorpiones se obtuvo 1,2 ml de veneno soluble.
Purificación de péptidos del veneno de H. charcasus
Para la cromatografía de filtración en gel, se aplicaron 15,46 mg de proteína del veneno a una columna de Sephadex G-75 (1,5 cm x 50 cm) en presencia de buffer acetato de amonio al 20 mmol/l, pH 4,7, a una velocidad de flujo de          500 µl/4min 13, las fracciones con actividad antimicrobiana, luego se separaron por cromatografía de intercambio iónico, en una columna de carboximetilcelulosa (CM-Sephadex C-25; 2 cm x 9 cm), equilibrada y desarrollada en presencia de buffer acetato de amonio, pH 4,7; con un gradiente continuo de 0 mol/l a 0,5 mol/l 14.
Composición del veneno y sus fracciones mediante método de electroforesis PAGE-SDS-Tricina
En condiciones desnaturalizantes fue realizada la electroforesis SDS-PAGE basados en el método de Schägger y Von Jagow 15, en una corrida a corriente constante y en gel de poliacrilamida al 15,0%. Para el buffer de corrida se empleó solución de tris-tricina-dodecil sulfato de sodio y como estándar de proteínas de rango bajo pre-teñidas (2 a 40 kDa) Thermo ScientificTM.
Los geles obtenidos, se revelaron por el método de tinción con plata (16). Finalmente, se registraron digitalmente los geles en el equipo ChemiDocTM XRS, Bio-Rad.
Actividad antimicrobiana del veneno H. charcasus
En esta parte de la metodología, se empleó el método de microdilución (
17,18 con la fracción IV y V de la cromatografía de filtración, se realizaron diluciones dobles seriadas, con un total de siete concentraciones, para la fracción IV de     3,6 mg/ml hasta 0,056 mg/mL y para la fracción V de 6,3 mg/mL hasta 0,098 mg/ml.
Para la preparación del inóculo, se emplearon cepas de E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 29213, P. aeruginosa ATCC 27853 y C. albicans ATCC 10231, se realizaron ensayos por triplicado sembrando 50 µL del inóculo conteniendo   5x104 UFC/ml en cada pocillo, luego se repartieron 50 µl de cada dilución, después se incubaron a 37 ºC durante 24 horas. Los controles positivos fueron caldo más inóculo, y los controles negativos solo caldo. El crecimiento del control positivo se determinó por un botón de crecimiento de ≥ 2 mm o una turbidez definida.  Se empleó el método Kirby-Bauer 19, para la sensibilidad antimicrobiana de las fracciones de la cromatografía de intercambio iónico, en las placas de agar Mueller-Hinton se sembraron con un inóculo de 1 a 2 x 108 UFC/ml.
El análisis de los datos se realizó usando el complemento MegaStat para Excel, con análisis varianza para determinar si los componentes proteicos purificados del veneno y las concentraciones empleadas si influyeron en el crecimiento microbiano.

RESULTADOS

A partir de 15,46 mg de proteínas total del veneno de H. charcasus, se analizaron por el método de cromatografía de filtración en gel Sephadex G-75, obteniendo cinco fracciones bien definidas de la cromatografía de filtración Sephadex G-75 (Figura 1), en el análisis del gel de electroforesis de Poliacrilamida (PAGE-SDS-Tricina), presentó un número variable bandas proteicas para cada uno de las fracciones purificadas, asimismo reveló para la fracción IV la presencia de siete bandas con rango de pesos moleculares de 9,8 kDa, 12 kDa, 15,1 kDa, 18,3 kDa, 24,3 kDa, 30,2 kDa y 37,5 kDa y para la fracción V se obtuvieron 6 bandas con rango de peso entre 5,1 kDa, 5,7 kDa, 7,9 kDa, 8,5 kDa, 10,7 kDa y 12,2 kDa respectivamente (Figura 2).


Figura 1. Purificación de las proteínas del veneno de H. charcasus por cromatografía de filtración en columna Sephadex G-75 con las fracciones (F-I, F-II, F-III, F-IV y F-V)


Figura 2. Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS - Tricina (PAGE-SDS-Tricina) de las proteínas purificadas, en el carril M marcador de peso molecular (2 – 40 KDa) (marcador de peso molecular) y fracciones de proteínas (FI - FV) y veneno total (VT).
En la evaluación de la actividad antimicrobiana se muestra en la fracción IV presentó una concentración mínima inhibitoria (CMI) de 3,6 mg/mL para las cepas de S. aureus ATCC 29213 y C. albicans ATCC 10231 y para las cepas de E. coli ATCC 25922 y P. aeruginosa ATCC 27853 no presentó inhibición total de crecimiento a las concentraciones empleadas respectivamente (Figura 3), para la fracción V no presentó inhibición total de crecimiento microbiano (Figura 4).


Figura 3. Actividad antimicrobiana de la fracción IV frente Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y Candida albicans ATCC 10231.

Figura 4. Actividad antimicrobiana de la fracción V frente a Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y Candida albicans ATCC 10231.
En la figura 5 se muestra el análisis de la separación de los péptidos por el método de cromatografía de intercambio iónico Sephadex C-25, se recuperaron al menos siete fracciones (OPDIV-1 a OPDIV-7), de los cuales al evaluar la actividad antimicrobiana mediante el método Kirby-Bauer, las cepas de E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 29213, C. albicans ATCC 10231 y P. aeruginosa ATCC 27853 presentaron sensibilidad frente a la fracción OPDIV-5 a concentración de 1µg/mL (tabla 1) y en el análisis de PAGE-SDS-Tricina, la fracción OPDIV-5 presentó cuatro bandas de pesos moleculares de 7,5 kDa,     6,4 kDa, 5,5 kDa y 4 kDa (Figura 6).


Figura 5. Purificación de la fracción IV (Sephadex G-75) con acción antimicrobiana, en cromatogradía de intercambio iónico Carboximetilcelulosa Sephadex C-25.

Figura 6. Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS - Tricina (PAGE-SDS-Tricina) de las proteínas purificadas de la fracción IV de la Cromatografía de intercambio iónico Sephadex C-25, en el carril M marcador de peso molecular (2 – 40 kDa) y fracción OPDIV-5.


Tabla 1. Sensibilidad antimicrobiana de las fracciones de la cromatografía de intercambio iónico (OPDIV-1 a OPDIV-7) frente a Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y Candida albicans ATCC 10231.
DISCUSIÓN

Actualmente los escorpiones son bien conocidos por sus picaduras peligrosas y sus venenos se han aplicado en la medicina tradicional, principalmente en Asia y África y se ha convertido en una valiosa fuente de moléculas biológicamente activas desde nuevos antibióticos hasta posibles terapias contra el cáncer (20), además de acuerdo a los reportes publicados el veneno de escorpión posee una fuente abundante péptidos antimicrobianos nuevos y potentes tanto como naturales o modificados químicamente con la finalidad ampliar su capacidad antibacteriana, antifúngica, antiparasitaria 21, 22. Los péptidos antimicrobianos son uno de los componentes del sistema inmune innato en una amplia gama de organismos eucariotas como humanos, plantas e insectos y que juegan un papel vital en los primeros mecanismos de defensa inmune contra los patógenos 23.
En el presente estudio se logró determinar la presencia péptidos antimicrobianos del veneno de H. charcasus esto es algo propio del veneno de los escorpiones tal como se evidencia de otras especies de escorpiones que demostraron e inclusive aislar péptidos con potencial acción antimicrobiana como las pantininas de Pandinus imperator 24, los péptidos TsAP-1 y TsAP-2 de Tityus serrulatus 25 péptidos del veneno de Scorpio maurus palmatus 26 y los péptidos HsAp del escorpión Heterometrus spinifer 27.
Además, en el presente trabajo mediante el empleo de dos métodos cromatográficos, uno de filtración en gel y otro de intercambio iónico permitió separar las proteínas en fracciones. Cuando el veneno crudo se separó por columna Sephadex G-75, se obtuvieron 5 fracciones, siendo evidente la fracción IV con actividad antibacteriana frente a S. aureus y antifúngica frente a C. albicans. Esta fracción relacionada con su actividad antimicrobiana fue purificada y analizada en CM Sephadex C-25, obteniendo 7 fracciones, de los cuales la quinta fracción denominada OPDIV-5 contiendo péptidos con pesos moleculares de 7,5 kDa, 6,4 kDa, 5,5 kDa y 4 kDa mediante el método Kirby–Bauer se encontró actividad frente E. coli, S. aureus, P. aeruginosa y C. albicans.
Esto es característico de los péptidos antimicrobianos que por lo general presentan peso molecular por debajo de 8,5 kDa como es el caso de las familias de las opiscorpinas del escorpión Opistophthalmus carinatus 28, vejonina de Vaejovis mexicanus 29 Heterinas de Heterometrus spinifer 30, demostrando su amplia acción antibacteriana y antifúngica.
La purificación parcial de la fracción OPDIV-5 conformado por cuatro péptidos con carga positiva que al interactuar con las cargas negativas de la CM Sephadex C-25, solo se pudo eluir aumentando la concentración del acetato de amonio, además, presentó actividad antibacteriana como actividad antifúngica. esto se debió al empleó mayor concentración del buffer acetato de amonio con la finalidad de recolectar péptidos de naturaleza catiónica y con mayor carga.
Los péptidos antimicrobianos del veneno de escorpión son péptidos anfipáticos cargados positivamente, se manifiesta en los péptidos meuVAP-6, meuAP-18-1 y meuPep34 de Mesobuthus eupeus 31, inclusive en los péptidos VpAmp de Vaejovis punctatus, por presentar acción contra bacterias gram positivas y contra C. albicans y frente a bacterias gram negativas, 32, similar fue para los péptidos UyCT de Urodacus yaschenkoi por tener predilección por bacterias gram positivas 33, péptido antibacteriano de Centruroides margaritatus 34.
CONCLUSIONES
El veneno de H. charcasus, posee péptidos de naturaleza catiónica, con capacidad antimicrobiana frente a microorganismos patógenos de importancia clínica.
AGRADECIMIENTOS
Agradecimiento al Grupo de Investigación en Proteínas de la Universidad Nacional de Colombia sede en Bogotá, por la oportunidad para el desarrollo del trabajo de investigación.

CONFLICTO DE INTERESES
Los autores declaramos no presentar conflictos de interés potenciales con respecto a la investigación, autoría y/o publicación de este artículo.
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Disponible en: http://www.scielo.org.pe/pdf/rpb/v17n1/a16v17n1.pdf
Recibido: 10 marzo 2021
Aceptado: 5 julio 2021

Orlando Pérez-Delgado 1, Clara Andrea Rincon-Cortés 2, Nohora Angélica Vega-Castro 3, Edgar Antonio Reyes-Montaño 4, Marcela Gómez-Garzón 5,
1. Universidad Señor de Sipán* https://orcid.org/0000-0002-5849-1047
2. Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales  https://orcid.org/0000-0002-7236-7456
3. Universidad Nacional de Colombia. https://orcid.org/0000-0001-5938-676X
4. Universidad Nacional de Colombia https://orcid.org/0000-0003-0921-2125
5. Fundación Universitaria de Ciencias de la Salud. https://orcid.org/0000-0003-0584-8783
*Autor correspondencia, Chiclayo-Perú, +51950630134, operezd@gmail.com
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