2016.01.03.3 - Revista bionatura

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2016.01.03.3

Número > Archivos > Vol 1 No 3 2016 > Investigaciones
INVESTIGACIÓN   
 
Evaluación   del proteinograma plasmático del cocodrilo cubano (Crocodylus rhombifer)   
Evaluation   of plasmatic proteinogram of cuban crocodile (Crocodylus rhombifer)


Available from: http://dx.doi.org/10.21931/RB/2016.01.03.3

Vivian Morera, Arline Fernández, Claudia Puentes, Etiam Pérez, Gustavo Sosa, Leiter Guerra, Félix Santanay Yoamel Milian



RESUMEN   
El cocodrilo cubano (Crocodylus rhombifer) es una especie endémica de Cuba y en Peligro  Crítico de extinción. Con el objetivo de preservar esta especie en   la Ciénaga de Zapata, Matanzas, Cuba se mantiene una población en  cautiverio. El manejo de una especie en esta categoría tiene como componente esencial el conocimiento del estado de salud de los animales en las diferentes etapas de la vida. El estudio de las proteínas plasmáticas constituye una herramienta eficaz en la clínica veterinaria para determinar la presencia de enfermedades en los cocodrilos. El objetivo de este trabajo fue evaluar el   proteinograma plasmático en cuanto a la concentración total de proteínas   en el plasma de Crocodylus rhombifer y a las concentraciones de sus fracciones  proteicas. Las muestras se tomaron de 35 ejemplares cautivos clínicamente sanos, divididos en dos categorías: juvenil (n=20) y sub-adulto (n=15). Adicionalmente, se tomaron muestras de 8 ejemplares procedentes del medio natural.  La concentración total de proteínas en el plasma se determinó mediante el método colorimétrico del ácido bicinconílico.  Las proteínas del plasma fueron fraccionadas empleando electroforesis en geles de agarosa y electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil  sulfato sódico. Mediante espectrometría de masas se identificaron las principales proteínas plasmáticas. La identificación por  espectrometría de masas mostró la presencia de albúmina fosforilada en el plasma de los animales. Los valores de concentración total de proteínas  y de albúmina fueron mayores en los animales cautivos que en los de medio   natural, siendo más altos los de la categoría sub-adulto. Contrariamente, las γ globulinas presentaron mayores valores de concentración en los animales procedentes del medio natural. No se encontraron diferencias significativas en la concentración de las fracciones proteicas entre animales en las distintas etapas del desarrollo. En la categoría juvenil la fracción β globulina mostró mayor concentración y la fracción γ la  menor concentración. Lo opuesto fue encontrado para la categoría sub-adulto. Los resultados de este estudio constituyen el primer informe sobre el proteinograma plasmático de Crocodylus rhombifer en cautiverio y aportan una herramienta  bioquímica para contribuir al manejo adecuado de esta especie en cautiverio.    
Palabras clave:   Crocodylus rhombifer , proteinograma, proteínas, plasma.

ABSTRACT   
Cuban crocodile (Crocodylus rhombifer) is an endemic and critically endangered species.   In order to preserve this species a population of them is maintained in captivity   in the farm "Zapata Swamp", Matanzas, Cuba. To manage such species, the knowledge   of the animal health status, in different stages of live, is an essential component. The plasmatic proteinogram is an effective tool in veterinary medicine to determine the presence of diseases in crocodiles. The goal of this thesis was the evaluation   of the plasmatic proteinograma, taking into account the total protein concentration and the relationship between its fractions. Samples were taken from clinically healthy 35 captive animals, divided in two categories: juveniles (n=20) and   sub-adults (n=15) and additionally 8 animals from the natural environment. The total protein concentration was determined using bincinconilic acid method. The plasma proteins were separated using electrophoresis on agarose gels and   polyacrylamide gels. By mass spectrometry were identified the main plasmatic proteins. The identification by mass spectrometry showed the presence of phosphorylated   albumin. The values of total protein concentration and albumin were higher in   captive animal, being the highest those corresponding to sub-adults. Contrarily,  the γ globulins fraction was higher in wild animals. For animals with different   development stages no significant difference were found. In juveniles, β  fraction was higher and γ fraction was lower. In sub-adults, the opposite   was found. The results of this thesis are the first report concerning the characterization   of plasmatic proteinogram of Crocodylus rhombifer in captivity.
Keywords   : Crocodylus rhombifer, proteinogram, proteins, plasma.

 
INTRODUCCIÓN    
El Crocodylus rhombifer1 es una especie endémica de Cuba y la más amenazada dentro de la familia Crocodylidae. Su distribución en el archipiélago cubano está limitada a 300 km2 en la Ciénaga de Zapata, Matanzas y a 100 km2 en la Ciénaga de Lanier, Isla de la Juventud.   Las principales amenazas a esta especie son la caza indiscriminada, la destrucción  de su hábitat natural y la hibridación con Crocodylus acutus2. Crocodylus rhombifer es un miembro clave de la herpetofauna cubana para la conservación del principal humedal cubano: la Ciénaga de Zapata. Esto se debe a que mantiene la estructura dinámica y la función del ecosistema porque realiza actividades como la depredación selectiva de   especies de peces, el reciclamiento de nutrientes y el mantenimiento de refugios  con agua durante las sequías 3. Esta especie está incluida   en el apéndice I por la Convención Internacional para el Comercio   de Flora y Fauna Silvestres (CITES) y en el Libro Rojo de la Unión Internacional   para la Conservación de la Naturaleza y los Recursos Naturales (UICN) bajo   la categoría de especie En Peligro Crítico de Extinción4. Una alternativa para el mantenimiento de una especie cuando las poblaciones naturales están casi agotadas es su reproducción en cautiverio, es   decir animales nacidos y levantados exclusivamente en un medio controlado, donde el criador les suministra un espacio idóneo, alimento, limpieza, cuidado   sanitario y protección contra la depredación.
El manejo en cautiverio   de una especie en peligro de extinción requiere el conocimiento de la situación   de salud de los animales. Los cocodrilos enfermos en condiciones de cautiverio   muestran signos clínicos inespecíficos lo que hace difícil identificar   su estado y predecir la aparición de enfermedades por simple observación.   Por otra parte, al ser animales ectotermos y variar su temperatura corporal en la misma dirección que la temperatura ambiental, la medición de   esta no puede ser empleada como una herramienta clínica. Sin embargo, algunos   parámetros bioquímicos de la sangre como las proteínas plasmáticas  constituyen una valiosa ayuda en el diagnóstico de ciertas enfermedades5,6. Esto se debe a que las proteínas plasmáticas tienen funciones importantes como el mantenimiento de la presión osmótica,  el equilibrio ácido-base, el transporte de metabolitos como los lípidos   y las hormonas y algunas de ellas juegan un papel importante en la defensa del organismo frente a patógenos. Es por ello que la medición de estas proteínas refleja el estado de salud de los individuos 7.
La electroforesis   de proteínas es actualmente la técnica de referencia para el fraccionamiento  de las proteínas del plasma. Aun cuando su especificidad diagnóstica   es baja, los resultados de la electroforesis de las proteínas plasmáticas   constituyen una herramienta útil en Clínica. En particular, la electroforesis   nativa de las proteínas del plasma en geles de agarosa es una de las técnicas   más empleadas por su buena resolución, reproducibilidad y claridad   de las bandas. En este tipo de electroforesis las proteínas son separadas en función de su carga ya que el tamaño del poro es tan grande que   el gel no ejerce la función de tamizaje en virtud del tamaño molecular. De esta manera, las proteínas del plasma pueden ser fraccionadas en las   cinco bandas clásicas correspondientes a albúmina, seguida de varias bandas de globulinas denotadas consecutivamente como α1, α2, β   y γ globulinas8.
La información   relacionada con el proteinograma plasmático para la especie Crocodylus  rhombifer resulta inexistente. El propósito de este estudio fue determinar los valores de concentración total de proteínas del plasma y de sus   diferentes fracciones para Crocodylus rhombifer y establecer las posibles   diferencias atribuibles a la etapa del desarrollo.
 
MÉTODOS   
Animales y  muestras
Se emplearon 35   ejemplares de Crocodylus rhombifer mantenidos en cautiverio en el criadero  "Ciénaga de Zapata", Matanzas, Cuba y 8 ejemplares del medio natural. Los  animales provenientes del medio natural fueron capturados en la región y trasladados al criadero para su estudio. Los animales mantenidos en cautiverio  fueron alimentados una vez por semana con desperdicios de ganado vacuno. El estado de salud aparente se evaluó por observación del estado general,   la vivacidad, el dinamismo, el apetito, la coloración de la piel y las  mucosas, así como la ausencia de lesiones externas. Los cocodrilos fueron   capturados manualmente con la ayuda de una cuerda sin utilizar narcóticos o tranquilizantes. La extracción de sangre se realizó por punción   cardíaca y se tomó 5 mL de cada animal. Las muestras se colectaron empleando jeringas estándar de 10 mL humectadas con EDTA 0.05 mol/L y sealmacenaron en tubos Vacutainer que contenían EDTA como anticoagulante (VACUETTE® K3E K3EDTA, Greiner Bio-one GmbH, Austria). Durante el muestreo  la sangre se mantuvo en un termo con hielo. El plasma se obtuvo por centrifugación   a 2000 g durante 15 min a 4oC en una centrífuga Sigma (Alemania). Este se conservó a -20°C hasta el momento de los análisis.
Determinación   de la concentración total de proteínas
La concentración  total de proteínas en el plasma de cada animal se determinó mediante  la técnica colorimétrica del ácido bicinconílico (BCA). Se empleó el protocolo en placas de 96 pozos del juego de reactivos ``Ensayo  de Proteínas BCA" (Thermo Scientific, EUA). Para la realización de este ensayo se utilizó como proteína patrón la albúmina  bovina de suero (BSA) y se realizaron diluciones seriadas a diferente concentración   en el rango de 125-1500 μg/mL. Las determinaciones se realizaron por triplicado.  Como control positivo del ensayo se empleó la proteína patrón diluida con agua 1:2 (v:v). La lectura se realizó a 540 nm en un lector de placas (Merck Sensident Scan, Finlandia).
Electroforesis   en geles de agarosa
Se utilizó como soporte electroforético agarosa para proteínas plasmáticas   (Biozym ME agarose, Biozym, Alemania). El gel se preparó al 2% en tampón de corrida. El tampón de corrida fue tris-ácido bórico 90 mmol/L,   pH 8.5. La solución tampón de muestra consistió en glicerol al   30 % conteniendo 0.0005g de bromofenol azul. La corrida se realizó con   el gel sumergido en solución de corrida en una cámara horizontal durante 75 minutos; se aplicó un voltaje de 100 Volt. La fijación se realizó durante 15 min con una solución de etanol, ácido acético y agua destilada (1:6:3, v:v:v). Los geles se tiñeron utilizando una solución de Negro amida. La solución de distinción contenía ácido acético glacial, etanol absoluto y agua destilada (1:4.5:4.5, v:v:v); el tiempo de distinción fue de aproximadamente 24 horas.
Electroforesis   en geles de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato sódico
La electroforesis  en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato sódico se realizó en geles al 10 % y con el protocolo básico de Laemmli9. Para las corridas se utilizó una cámara Mini-Protean II (Bio-Rad, EUA) y una corriente de 30 mA generada con una fuente (Pharmacia, Suecia). Las muestras   se mezclaron con tampón de desnaturalización 2x: 0.125 mol/L Tris-HCL, SDS al 2 %, glicerol al 25%, gotas de bromofenol azul y β-mercaptoetanol al 5%, pH 6.8 y se calentaron a 100oC durante 5 min en un baño de arena (Thermolyne, EUA). Luego de la corrida los geles se colocaron en la   solución de fijación compuesta por ácido acético al 10 %,   etanol al 40 % y agua destilada al 50%. Para la tinción de los geles se   utilizó una solución coloidal de Coomassie azul brillante G-250 al   0,1 %, ácido ortofosfórico al 2 % y sulfato de amonio al 10 %. Los   geles se decoloraron mediante lavados con agua destilada. Se utilizó un patrón comercial de bajas masas moleculares (Bio-Rad, EUA). Para la identificación   de las proteínas mayoritarias del plasma mediante espectrometría de   masas los geles se tiñeron con plata10.
Determinación   de la concentración total de proteínas de las fracciones obtenidas   mediante electroforesis
La determinación   de la concentración total de proteínas de las fracciones separadas mediante electroforesis en gel de agarosa se realizó utilizando el programa  TotalLab versión 1.10 (EUA). Este programa permite la selección del   área coloreada de cada fracción y calcula el porciento que representa cada una del total de fracciones en la carrilera. Con estos datos se calcula   la concentración total de proteínas en cada fracción utilizando   la siguiente fórmula:


donde  C, es la concentración total de proteína en cada banda; CBCA, es la  concentración total de proteínas en el plasma antes del fraccionamiento  mediante electroforesis y determinada por el método colorimétrico  del BCA y % banda, es el porcentaje obtenido con el programa TotalLab versión   1.10 (EUA).
Digestión   de proteínas en el gel
Los fragmentos de gel, directamente obtenidos de la SDS-PAGE, se lavaron 3 veces con agua durante  10 min cada vez. Posteriormente, se cortaron en cubos de aproximadamente 1 mm2  y se deshidrataron con 1 mL de acetonitrilo al 90 % con agitación durante   5 min. Después de retirada la solución, las muestras se secaron 5  min en una centrífuga concentradora al vacío y se rehidrataron con   una solución de tripsina a 12.5 ng/mL en bicarbonato de amonio 0,05 mol/L.   Se digirió durante 16 h a 37°C. Los péptidos trípticos se desalaron en micro columnas ZipTips C18 activadas con una solución de acetonitrilo   al 60 %, ácido fórmico al 1% y equilibradas con una solución   de ácido fórmico al 1 %. La mezcla de péptidos se eluyó   con 3 µL de una solución de acetonitrilo al 60 %, ácido fórmico   al 1%.
Espectrometría   de masas
Los espectros  de masas se obtuvieron en un espectrómetro de masas híbrido con geometría  ortogonal QTOF-1 TM (Micromass, Reino Unido) equipado con fuente de ionización   por electronebulización Z-spray. El capilar de entrada se sometió a 1200 V y el voltaje del cono fue de 35 V. El analizador se calibró usando   yoduro de sodio y cesio como referencia, en el rango de m/z de 50 a 2000 Th.   Para la obtención de espectros MS/MS de señales mono, doble y triple  cargadas cuyas intensidades en el espectro ESI-MS sobrepasaran 15 conteos/segundos,  se empleó una ventana de detección de 4 Th. La energía de colisión   para la fragmentación fue previamente definida tomando en consideración  el estado de carga. La identificación de proteínas basada en los espectros MS/MS, se realizó empleando el programa MASCOT 11 y la base  de datos UniProtKB12.
Análisis   estadístico
Se comprobó   la normalidad de los datos mediante una prueba Kolmogorov-Smirnov y la homogeneidad   de varianza mediante una prueba Levene. Se calcularon los valores de media,   desviación estándar, intervalo de confianza y mínimo-máximo de la: concentración total de proteínas en plasma, de albúmina,  de α1 globulinas, de α2 globulinas, de β globulinas, de γ globulinas, de globulinas totales y la relación albúmina-globulinas  para los tres grupos estudiados. Se realizó una prueba t de Student para   comparar la concentración de: proteínas en plasma, albúmina, α1 globulinas, α2 globulinas, β globulinas, γ globulinas, de globulinas totales y la relación albúmina-globulinas de acuerdo a etapa del desarrollo. Todos los cálculos fueron realizados con el programa Statistic versión 8.0 (StatSoftInk) teniendo en cuenta un grado de significación   p< 0.05 y los intervalos de confianza del 95%.
 
RESULTADOS   
La clasificación de los animales por categorías se realizó teniendo en cuenta los parámetros establecidos por los especialistas del criadero. Ellos consideran los valores   de largo total como puntos de corte: categoría juvenil, entre 60 y 149  cm, categoría sub-adulto, entre 150 y 179 cm y categoría adulto mayores   de 180 cm. El sexo de los animales se determinó mediante examinación   manual (Fig. 1). De los animales cautivos, 20 clasificaron en la categoría   juvenil. De ellos, 17 animales resultaron hembras y 3 machos. En la categoría  sub-adulto clasificaron 15 animales, de ellos 13 resultaron hembras y 2 machos. De los animales provenientes del medio natural, 1 ejemplar clasificó como   juvenil, 4 como sub-adultos y 3 como adultos. En este grupo 7 animales eran  machos y 1 hembra.



Para la población global en cautiverio el valor promedio de concentración total de proteínas  en el plasma fue de 5.41 g/dL y los valores oscilaron entre 3.53 y 7.53 g/dL.  En el grupo de animales cautivos con categoría juvenil el valor promedio de concentración total de proteínas en el plasma fue de 5.30 g/dL   y los valores oscilaron entre 4.24 y 7.18 g/dL. Para los animales cautivos con categoría sub-adulto el valor promedio de concentración total de proteínas   en el plasma fue de 5.55 g/dL y los valores oscilaron entre 3.53 y 7.53 g/dL. Los animales del medio natural presentaron un valor promedio de concentración  total de proteínas en el plasma de 4.89 g/dL, y los valores oscilaron entre   2.30 y 6.91 g/dL (Tabla 1). Para evaluar la variabilidad de  la concentración total de proteínas en el plasma en cuanto a etapa   del desarrollo y a procedencia se aplicaron pruebas t de Student. Para ello se compararon los grupos de animales cautivos con categoría juvenil y sub-adulto,   y los grupos de animales cautivos con categoría sub-adulto y los animales  procedentes del medio natural, respectivamente. Ambos análisis revelaron la presencia de diferencias no significativas entre los grupos comparados (p>0.05).    




El perfil típico  del proteinograma plasmático obtenido para Crocodylus rhombifer en   gel de agarosa al 2% mostró 6 fracciones proteicas. En el perfil electroforético  la albúmina se identificó por su cercana migración a la de una  muestra de albúmina bovina de suero, aplicada en el gel como referencia  de masa molecular (resultados no mostrados). La banda que migró más  próxima al ánodo se asignó a albúmina fosforilada (Fig.   2). Esta asignación fue posible tras el análisis de una muestra   de plasma tratada con agentes reductores mediante SDS-PAGE, seguido de la digestión   proteolítica con tripsina de las principales bandas de proteínas y   el análisis de los péptidos por espectrometría de masas en sucesión   (EM-MS/MS) (Fig. 3). La identificación de las proteínas   plasmáticas mayoritarias se basó en las secuencias de los péptidos   trípticos obtenidas a partir de los espectros MS/MS (Tabla   2). Las bandas 1-5 correspondieron a la α2 macroglobulina, la transferrina,   la cadena pesada de la inmunoglobulina y la albúmina sérica, respectivamente.   Todas las proteínas fueron identificadas con más de un péptido   y el porcentaje de homología entre las secuencias obtenidas en este trabajo   y las secuencias homólogas informadas en la base de datos resultó   superior al 64% (Tabla 2). Las secuencias homólogas,   en todos los casos, correspondieron a especies del Orden Crocodylia. La cadena   pesada de la inmunoglobulina y la albúmina sérica fueron identificadas   en las bandas 4 y 5, con un total de 9 y 6 péptidos, respectivamente. De  ellos, 3 resultaron péptidos fosforilados. La diferencia de masas de 80   Da entre la señal m/z del ion precursor (1678.66 m/z) y la señal del   primer fragmento obtenido (1598.83 m/z) sugiere la presencia en esa secuencia   de un aminoácido fosforilado (Tabla 2, Fig.   3).


 
Tabla 2. Resumen de la identificación de las proteínas plasmáticas mayoritarias de Crocodylus rhombifer basada en los espectros MS/MS. En rojo se destacan las diferencias puntuales encontradas entre las secuencias obtenidas en este trabajo y las secuencias informadas en la base de datos UniProtKB*. En negritas se destacan las secuencias correspondientes a péptidos fosforilados, encontrados en este trabajo.

m/z – relación masa-carga del ión
 
 
XXX– aminoácidos no identificados en el espectro MS/MS
 
*http://www.uniprot.org

La determinación  de la concentración total de proteínas de cada fracción obtenida  mediante electroforesis en gel de agaroa se realizó por análisis  densitométrico. A partir del porcentaje que representó cada fracción  en el porcentaje total de las fracciones en la carrilera se determinó la  concentración de cada una. El valor de albúmina se consideró  como la suma de las fracciones correspondientes a la albúmina nativa y  la albúmina fosforilada. Para la población global de animales en cautiverio  (n=35) se obtuvo un valor promedio de la concentración total de proteínas por fracción de: albúmina 1.95 g/dL, α1 globulinas 0.68 g/dL,  α2 globulinas 0.37 g/dL, β globulinas 0.91 g/dL y γ globulinas 1.49 g/dL. El valor promedio de globulinas totales resultó 3.46 g/dL y  la relación albúmina-globulinas 0.56. Para el grupo de animales del medio natural (n=8) se obtuvo un valor promedio de la concentración total  de proteínas por fracción de: albúmina 1.50 g/dL, α1 globulinas 0.54 g/dL, α2 globulinas 0.38 g/dL, β globulinas 0.71 g/dL y γ globulinas 1.70 g/dL. El valor promedio de globulinas totales y de la relación   albúmina-globulinas resultó 3.39 g/dL y 0.44, respectivamente (Tabla   3).



Para el grupo de animales cautivos con categoría juvenil (n=20) se obtuvo un valor promedio de la concentración total de proteínas por fracción de: albúmina 1.86 g/dL, α1 globulinas 0.67 g/dL, α2 globulinas 0.37 g/dL, β   globulinas 0.95 g/dL y γ globulinas 1.44 g/dL. El valor promedio de globulinas totales y de la relación albúmina-globulinas resultó 3.44 g/dL  y 0.54, respectivamente. Para el grupo de animales cautivos con categoría sub-adulto (n=15) se obtuvo un valor promedio de la concentración total   de proteínas por fracción de: albúmina 2.07 g/dL, α1 globulinas 0.69 g/dL, α2 globulinas 0.37 g/dL, β globulinas 0.86 g/dL y γ globulinas 1.56 g/dL. El valor promedio de globulinas totales y de la relación  albúmina-globulinas resultó 3.48 g/dL y 0.60, respectivamente (Tabla   4).


La comparación de la concentración total de proteínas de las fracciones proteicas  separadas mediante electroforesis en geles de agarosa se realizó mediante un ANOVA de clasificación simple y se compararon los grupos de animales cautivos con categoría juvenil, animales cautivos con categoría sub-adulto   y los animales procedentes del medio natural. Se observó que el mayor valor de albúmina correspondió a los animales cautivos con categoría   sub-adulto, mientras que el menor valor de esta proteína correspondió a los animales del medio natural. El ANOVA reveló que las diferencias en   la concentración de albúmina son significativas (F= 4.99 y p= 0.01).   Por otra parte, seobservó que el valor de relación albúmina-globulinas es mayor para el grupo de animales cautivos con categoría sub-adulto. El  menor valor de esta variable se obtuvo para los animales procedentes del medio   natural. El ANOVA reveló que las diferencias entre los valores de relación   albúmina-globulinas para los tres grupos son altamente significativas (F=   10.96 y p= 0.0001).
La concentración  de globulinas totales no demostró variaciones significativas entre los   grupos comparados (p=0.96). Las fracciones α1 globulinas, α2 globulinas  y γ globulinas no mostraron diferencias entre los grupos (p>0.05). El   mayor de valor de la fracción de las γ globulinas se observó  en los animales del medio natural y el menor valor para el grupo de animales cautivos con categoría juvenil. La fracción correspondiente a las   β globulinas mostró diferencias significativas entre los grupos (F=  3.79 y p= 0.03); el mayor valor de esta fracción correspondió al grupo   de animales cautivos con categoría juvenil y el menor valor a los animales   del medio natural.
DISCUSIÓN   
Las proteínas plasmáticas están involucradas en casi todos los procesos biológicos vitales por lo que el estudio del proteinograma plasmático resulta útil   en la evaluación del estado de salud o enfermedad, así como del estado  nutricional de muchas especies. La medición de estas proteínas se emplea para diferenciar los estados de enfermedad agudos de estados crónicos    13. En este trabajo se determinó la concentración total  de proteínas plasmáticas y de sus fracciones para una muestra de la   población cautiva de Crocodylus rhombifer del criadero "Ciénaga de Zapata", Matanzas, Cuba. Los resultados obtenidos se compararon con un grupo de animales procedentes del medio natural. Las variaciones eventuales debido  al efecto postprandial y el ritmo circadiano que pudieran registrarse en la  concentración total de proteínas fueron excluidas del diseño experimental debido a que la toma de las muestras se realizó en horas tempranas   de la mañana y en ayuno.
El rango de valores de concentración total de proteínas plasmáticas para la población  cautiva estudiada de Crocodylus rhombifer, así como el valor experimental promedio obtenido están dentro del rango de valores informado para la clase  Reptilia 14. Aunque casi todas las especies de reptiles estudiadas   se encuentran dentro de este rango, es posible observar variaciones entre órdenes,  familias, géneros, especies e incluso individuos de una misma especie 15.   En la tabla 5 aparecen los valores de concentración total de proteínas, albúmina, globulinas totales y relación albúmina-globulinas   para algunas especies que pertenecen al Orden Crocodylia, específicamente   de las familias Alligatoridae y Crocodylidae. La variabilidad y los amplios   rangos de estos valores pueden ser atribuidos a las particularidades fisiológicas de los reptiles ya que los parámetros sanguíneos fluctúan considerablemente   en función del sistema de alimentación, el hábitat, el clima, el sexo y la edad 16-19.


La cuantificación de proteínas totales, el perfil electroforético (proteinograma) y   la relación albúmina-globulinas se emplean en el diagnóstico   de las alteraciones protéicas. En particular la relación albúmina-globulinas resulta de especial interés en Clínica, ya que este parámetro permite la clasificación sistemática del perfil electroforético y la identificación de las disproteinemias20. En este trabajo los valores de concentración total de proteínas en el plasma atendiendo a la etapa de desarrollo no resultaron significativamente diferentes (categoría   juvenil contra categoría sub-adulto) o procedencia (categoría sub-adulto   contra medio natural) (p>0.05). Sin embargo, nuestros resultados arrojaron   el mayor valor promedio de concentración total de proteínas en el   plasma de los animales cautivos con categoría sub-adulto y el menor, en   el plasma de los animales procedentes del medio natural. En correspondencia  con este hecho, se encontró el mayor valor de concentración de albúmina   en el grupo de animales cautivos con categoría sub-adulto y el menor valor  en los animales del medio natural y las diferencias de este parámetro resultaron   significativas. Por otra parte, se observó que el valor de relación   albúmina-globulinas es mayor para el grupo de animales cautivos con categoría   sub-adulto y menor para los animales procedentes del medio natural. El ANOVA   reveló que las diferencias entre los valores de relación albúmina-globulinas   para los tres grupos son altamente significativas. Los animales cautivos empleados   en este estudio fueron alimentados una vez por semana, con una dieta rica en   proteínas, mientras que los animales del medio natural se alimentan de   una manera más irregular en frecuencia y componentes de la dieta. La relación   entre la dieta y la concentración total de proteínas plasmáticas   es bien conocida y se fundamenta en el hecho de que la albúmina es la proteína   mayoritaria del plasma. Su síntesis ocurre en el hígado a una tasa   que depende de la ingestión de proteínas. Una dieta escasa en proteínas provoca una disminución de alrededor del 50% en la síntesis de albúmina   en 24 horas 21. Por lo tanto, su contribución a la concentración total de proteínas y a la relación albúmina-globulinas es significativa.  Algunos autores, empleando electroforesis en acetato de celulosa y valoración   densitométrica, han obtenido resultados similares en una población   cautiva de Caiman latirostris y Caiman yacare (categoría   sub-adulto): el suministro regular de alimentos promueve los valores de proteína total, albúmina y relación albúmina-globulinas a mayores valores que en animales de Zoológico22. Similares resultados han sido encontrados por Uhart y colaboradores23 para Caiman yacare.  En un estudio con Rana catesbeiana, anfibio de vida acuática filogenéticamente relacionado con los reptiles, se ha determinado que los valores de concentración   total de proteínas y de albúmina en el suero son directamente proporcionales a la cantidad y calidad de la proteína dietaria 24 y en caimanes se ha demostrado que el cambio del alimento habitual, rico en carne bovina,  a una dieta compuesta por harina de carne y sangre produce un incremento de   la albumina sérica25.
Entre otros factores   que determinan la alta variabilidad encontrada en los valores experimentales de concentración total de proteínas en el plasma de los reptiles podemos mencionar el método empleado para su determinación. Para este fin no existe un sistema completamente satisfactorio, por lo que elegir el método a emplear dependerá de la cantidad de muestra de la que disponga el investigador,   de la necesidad o no de recuperar la muestra intacta, de la presencia de compuestos   que pudieran interferir y afectar la especificidad y por último de la sensibilidad,   la precisión y la reproducibilidad que se requieran en el estudio. Los   métodos de unión a colorantes se utilizan con frecuencia, pero sufren de alta variabilidad entre las proteínas de diferentes especies y esto se debe a la diferente afinidad de las proteínas por los colorantes26.  Algunos trabajos con reptiles emplean la técnica colorimétrica del   Biuret 27-34. Con esta técnica es posible detectar concentraciones de proteínas de hasta 0.5 mg/mL pero se requieren  grandes cantidades de muestra 35. El método colorimétrico del ácido bicinconílico empleado en este estudio, sigue el mismo principio   que la reacción del Biuret pero presenta la ventaja de ser un juego de   reactivos comercial optimizado lo que garantiza mayor reproducibilidad en los   resultados y mayor sensibilidad del ensayo. Este método permite determinar la concentración total de proteínas en el orden de los μg/mL36.   En particular para la determinación de la albúmina en plasma y a pesar de que ha demostrado ser un método poco preciso para especies no mamíferas,  el empleo del colorante verde de bromocresol ha sido sugerido por algunos autores    37-39. Sin embargo, se reconoce que la electroforesis seguida del  análisis densitométrico permite medir la albúmina presente en   el plasma de una manera más precisa que los métodos basados en el   empleo de colorantes. Considerando que algunos autores no describen las técnicas analíticas empleadas en la determinación de los valores de concentración total de proteínas y de albúmina en sus trabajos es muy difícil comparar los datos obtenidos en este trabajo para Crocodylus rhombifer con los datos obtenidos para otras especies del Orden.
La electroforesis nativa en gel de agarosa es una de las técnicas electroforéticas más   empleada para la separación de las proteínas plasmáticas. Con esta técnica electroforética las proteínas se analizan en su   estado nativo. A pH 8.5-9 ellas ganan cargas negativas y migran bajo la acción  del campo eléctrico, del electrodo negativo al positivo. El soporte, o sea el gel de agarosa, el cual a diferencia del gel de poliacrilamida tiene  poros muy grandes, limita sustancialmente la separación de las proteínas según su tamaño molecular y como resultado las proteínas se separan   en función de su densidad de carga superficial. Cuando las proteínas   del plasma se resuelven empleando esta técnica, este se fracciona en cinco o seis bandas dependiendo del ajuste del sistema electroforético empleado. Las bandas corresponden a la albúmina, las α1 globulinas, las α2   globulinas, las β1 globulinas, las β2 globulinas y las γ globulinas. Por densitometría se puede obtener un trazado que dibuja una serie de ondas o picos en correspondencia con cada una de las bandas. La superficie de cada pico es proporcional a la intensidad de color y tamaño de las bandas originales. El trazado varía de acuerdo a diferentes factores fisiológicos a saber: especie, sexo, edad, estado fisiológico, estado metabólico, aptitud   productiva y factores ambientales. La combinación de la electroforesis con la densitometría permite calcular la concentración relativa de las proteínas plasmáticas. Las condiciones seleccionadas y empleadas   en nuestro trabajo nos permitieron fraccionar el plasma de los cocodrilos en  6 fracciones.
Una de las potencialidades de la espectrometría de masas, es su capacidad de dilucidar la secuencia   de péptidos. Esto se realiza a través de la descomposición de la molécula ionizada en fragmentos generados durante el proceso de ionización.  A partir de las series de fragmentos N-terminal se obtiene la secuencia de aminoácidos   desde el extremo C hacia el N, mientras que la series de fragmentos C-terminal brindan la información secuencial del extremo N al C. La diferencia de masas entre señales consecutivas de iones correspondientes a una misma   serie, nos indica la pérdida de un aminoácido, la posición que  ocupa dentro de la secuencia y en el caso en que se obtengan valores de masas   inesperados, estos pueden relacionarse con modificaciones en la estructura de  los α-aminoácidos. De esta forma es posible determinar la secuencia   de péptidos de forma bidireccional y localizar modificaciones post-traduccionales. De todas las proteínas plasmáticas, la albúmina es la proteína   más pequeña y con mayor número de grupos cargados negativamente;  esta característica le permite migrar con mayor rapidez bajo la acción   de un campo eléctrico y en geles de agarosa es la fracción más próxima al ánodo. Sin embargo, en esa misma dirección y mucho   más próxima al ánodo se observó otra fracción proteica   que migró con mayor velocidad que la albúmina. Para establecer la   identidad de esa banda se empleó la espectrometría de masas mediante la secuenciación de sus péptidos trípticos. La diferencia de   masas de 80 Da entre la señal m/z del ion precursor y la señal del primer fragmento obtenido sugierió la presencia en esa secuencia de un   aminoácido fosforilado. A partir de este resultado identificamos a la banda  que migró en los geles de agarosa al 2 % más próxima al ánodo como albúmina fosforilada. La ausencia en la literatura científica de informes anteriores sobre la separación de una fracción de albúmina  fosforilada en el plasma de los cocodrilos puede deberse al hecho de que generalmente para la separación de las proteínas plasmáticas se utilizan sistemas electroforéticos automáticos o semiautomáticos. La mayoría  de estos sistemas emplean la electroforesis en acetato de celulosa, la cual   resulta menos resolutiva que la electroforesis en geles de agarosa, y tiempos de corrida que no sobrepasan los 30 minutos 40-42. La fosforilación  de las proteínas es una modificación post-traduccional muy importante porque regula la división y la diferenciación celular así como la función de las proteínas. La fosforilación y la desfosforilación catalizada por proteínas quinasas y fosfatasas puede modificar la función de las proteínas de casi todas las maneras posibles: aumentando o disminuyendo  su actividad biológica, estabilizándola o marcándola para su destrucción, facilitando o impidiendo su movimiento entre compartimentos  celulares, iniciando o disociando las interacciones proteína-proteína. La fosforilación de la albúmina encontrada en este estudio pudiera responder a uno de los mecanismos de regulación planteados para mediar los ritmos de síntesis y degradación de esta proteína en los cocodrilos 43 .
Conclusiones   
El valor promedio   de concentración total de proteínas en el plasma de una muestra de la población de Crocodylus rhombifer en cautiverio fue de 5.41 ±   0.92 g/dL. El rango de valores osciló entre los 3.53 - 7.53 g/dL. Estos valores están en el rango informado para la clase Reptilia. Mediante el empleo de la espectrometría de masas fue posible identificar la fosforilación  de la albúmina del plasma de Crocodylus rhombifer. A partir de este   hallazgo sugerimos que la fracción que migró más próxima  al ánodo en los geles de agarosa al 2% corresponde a la albúmina fosforilada. La electroforesis en gel de agarosa al 2% permitió separar el plasma en seis fracciones proteicas correspondientes a la albúmina fosforilada, la albúmina nativa, las α1 globulinas, las α2 globulinas, las β   globulinas y las γ globulinas. Los valores promedio de la concentración de proteínas de las diferentes fracciones del plasma de una muestra de la población de animales cautivos de Crocodylus rhombifer fueron: albúmina 1.95 ± 0.40 g/dL, α1 globulinas 0.61 ± 0.14 g/dL, α2 globulinas 0.37 ± 0.08 g/dL, β globulinas 0.91 ± 0.21   g/dL y γ globulinas 1.49 ± 0.39 g/dL. No se observaron diferencias significativas entre los valores de la concentración total de proteínas en el plasma y de las fracciones separadas mediante electroforesis en geles de agarosa entre los animales cautivos de acuerdo a la etapa del desarrollo.    
Agradecimientos   
Este trabajo fue  realizado gracias al soporte financiero recibido de la Fundación Alexander   von Humboldt de Alemania.

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Recibido: 14 de mayo de 2016.
Aprobado: 23 de junio de 2016.

Vivian Morera1, Arline Fernández2, Claudia Puentes2, Etiam Pérez3, Gustavo Sosa3, Leiter Guerra3, Félix Santana2 y Yoamel Milian2.
1 Universidad de Las Américas, Quito, Ecuador.
2 Universidad de La Habana, La Habana, Cuba.
3 Criadero Ciénaga de Zapata. Matanzas, Cuba.
Autor de correspondencia: Vivian Morera. Facultad de Ingeniería y Ciencias Agropecuarias. Universidad de Las Américas. Sede Queri: calle José Queri s/n entre Av. Granados y Av. Eloy Alfaro, Quito, Ecuador. Teléf. (593) 23981000 Ext. 112. Correo electrónico: vivian.morera@udla.edu.ec


cocodrilo cubano (Crocodylus rhombifer)

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