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Revision/Review

Número > Archivos > Vol 1 No 2 2016 > Revisiones

Mecanismos   de invasion del esporozoíto y merozoíto de Plasmodium  

Mechanisms   of invasion from sporozoite and merozoíto of Plasmodium  
  
Lilian M. Spencer1,2,   Andreina Gómez3, Eva Collovini4  
 

Resumen   
La malaria o paludismo   en el humano es causada por cuatro especies de Plasmodium pertenecientes   al phylum Aplicomplexa; ovale, malariae, vivax y falciparum,   siendo esta última la responsable de las complicaciones clínicas más   graves e incluso la muerte del hospedador vertebrado. El parásito Plasmodium   posee organelos secretores  especializados llamados rhoptrias, micronemas   y gránulos densos, los cuales facilitan la invasión a las células   hospedadoras.
El estadio de   esporozoíto del Plasmodium migra y penetra a través de diferentes   células en el hospedador vertebrado hasta llegar al hepatocito y formar   la vacuola parasitófora; la ruptura del hepatocito libera otro estadio   del parásito llamado merozoíto, el cual invade a los eritrocitos y   también forma una vacuola parasitófora. Los investigadores proponen   varios mecanismos de invasión como el movimiento de deslizamiento del esporozoíto    (Gliding motility en Inglés), mientras que la invasión del merozoíto   se realiza en tres pasos: contacto inicial, re-orientación e invasión.   En esta revisión nos enfocamos en las proteínas de superficie tanto   del esporozoíto como del merozoíto para el entendimiento de los mecanismos   moleculares de la invasión hasta la elaboración de la vacuola parasitófora.   Se hace referencia a las proteínas mas importantes que intervienen en estos   mecanismos y son posibles candidatas en el diseño de una vacuna anti-malárica.    
Palabras clave:     malaria, invasión, esporozoíto, merozoíto, Plasmodium.   

Abstract   
Malaria or paludismo   is caused in humans by four species of Plasmodium belonging to phylum   Apicomplexa: ovale, malaria, vivax and falciparum, being the last,   the responsible of the clinical complication and death in the vertebrate host.    Plasmodium parasite possess a specialized secretory organelles called   rhoptries, micronemes and dense granules that facilitate invasion of host cells.    
The sporozoite   stage of Plasmodium travels through the different cells of vertebrate   host until it reaches the hepatocyte and have been form the parasitophorous   vacuole. The infected hepatocytes rupture, results in the releasing thousands   of daughter merozoites that invade the erythrocytes with the formation of parasitophorous   vacuole too.
Several researchers   suggest the gliding motility mechanism as the responsible of hepatocyte invasion.   While, which the erythrocyte invasion process has been described as the result   of tree steps: first contact, re-orientation and invasion.
In this review   the surface proteins of merozoites and esporozoites are pointed out as the most   important factors for the molecular invasion mechanisms until the elaboration   of the parasitophorous vacuole. These proteins that take part in these mechanisms   are the possible candidates in the design of an anti-malaria vaccine.
Key   words: malaria, invasion, esporozoíto, merozoíto, Plasmodium.   

  
Introducción   
La malaria o paludismo   es causada por el parásito protozoario del género Plasmodium,   perteneciente al phylum Aplicomplexa. Existen cinco especies que infectan al   humano (hospedador vertebrado): ovale, malariae, vivax, falciparum   y knowlesis. Esta última se reportó como una zoonosis de primates   a humanos en regiones africanas1. La especie falciparum   es la más agresiva en relación a las manifestaciones clínicas,   y es responsable de la mayoría de las muertes  en el hospedador humano.   La Organización Mundial de la Salud en el 2011 reporto cerca de 216 millones   de personas infectadas de malaria y aproximadamente 655.000 muertes. Se estima   que la mitad de la población mundial está en riesgo de contraer la   enfermedad, por lo que es una prioridad desarrollar estrategias para el diseño   de una vacuna efectiva1. El parásito ha desarrollado una compleja   estrategia para adaptarse a sus hospedadores y evadir el sistema inmune. Uno   de los mecanismos recientemente descritos es la formación del merosoma,   proceso por el cual, los merozoítos que salen del hígado, evaden el   sistema inmune por estar dentro de una vesícula (merosoma) que se libera   en los vasos sanguíneos del hígado (sinusoides) antes de invadir a   los eritrocitos2.
Este parásito   presenta un ciclo de vida muy complejo (Fig. 1). Los parásitos   son transmitidos por un vector, la hembra del mosquito Anopheles, que   es portador del parásito al alimentarse de la sangre de un vertebrado infectado.   En el tubo digestivo del   mosquito se lleva a cabo el ciclo sexual   del parásito con la fecundación de los macro y micro gametos, y posteriormente   se desarrolla el zigoto motil llamado ookineto. Una división asexual da   origen al esporozoíto, que es el estadio infectante del vertebrado. Cuando   los esporozoítos que están en las glándulas salivares del vector   son inyectados dentro del hospedador vertebrado, son trasportados rápidamente   al hígado donde invaden a los hepatocitos3, en los cuales ocurre   una división asexual llamada esquizogonia hepática o ciclo extra-eritrocítico   que da origen al estadio llamado merozoíto. Este proceso de invasión   del esporozoíto ha sido extensivamente estudiado por varios investigadores4,5,6,7,   aunque poco se sabe del desarrollo y liberación del merozoíto proveniente   de las células hepáticas. En P. vivax  se ha descrito   otro estadio adicional llamado hipnozoíto, el cual queda latente en los   hepatocitos y puede activar la infección en un periodo relativamente corto   entre 10 a 30 semanas, siendo responsable de las recidivas de la enfermedad   8.



El merozoíto   es liberado al torrente sanguíneo con consiguiente invasión de los   eritrocitos en los cuales ocurre otra división asexual, llamada esquizogonia   eritrocítica. El merozoíto comienza la invasión al eritrocito   del cual se liberan más de 32 nuevos merozoítos en aproximadamente   48 horas, provenientes de un esquizonte maduro. Este esquizonte maduro estalla,   liberando y dispersando los nuevos merozoítos que re-invaden nuevos    eritrocitos. También,  a partir del esquizonte  maduro, se liberan   al torrente sanguíneo los gametocitos, los cuales son ingeridos por el   mosquito vector al picar al hospedador infectado y de esta forma se cierra el   ciclo del parásito.  En los procesos de invasión del esporozoíto   y merozoíto están involucradas numerosas proteínas y solo en   el merozoíto de P. falciparum se reportan más de 409.   Estas proteínas no solo se encuentran distribuidas en la superficie de   los diferentes estadios del parásito; sino también son secretadas   por organelos especializados como micronemas, roptrias y gránulos densos   que conforman parte del complejo apical y donde se presentan muchas de las proteínas   necesarias para el proceso de invasión y el establecimiento de la vacuola   parasitófora (VP) dentro de las células del hospedador10-12.    
Se ha reportado   un patrón de organización en las organelas que constituyen el complejo   apical, el cual es muy similar tanto en el esporozoíto como en merozoíto   (Fig. 2)13, 14.



En este trabajo   se hará hincapié en las proteínas más relevantes implicadas   en los mecanismos de invasión, tanto las del esporozoíto como del   merozoíto de P. falciparum. En el primer caso las mas importantes   son: la Proteína Anónima Relacionada con la Trombospondina (TRAP,   del inglés thrombospondin-related anonymous protein), y la Proteína   Circumesporozoitica (CSP, del inglés circumsporozoite protein); y en el   merozoíto: el Antígeno de Membrana Apical 1 (AMA 1, del inglés   apical membrane antigen 1), la Proteína de Superficie del Merozoíto   1 (MSP 1, del inglés merozoite surface protein 1) conocida también   como el Antígeno de Superficie del Merozoíto 1 (MSA 1, del inglés   merozoite surface antigen 1), y el Antígeno Unido al Eritrocito (EBA, del   inglés erythrocyte binding antigen). Otras proteínas son representadas   por la familia de Proteínas Roptrias (RAP, del inglés rhoptrias antigen   protein), el Antígeno de Superficie del Eritrocito en Anillo Infectado   (RESA, del inglés ring-infected erythrocyte surface antigen), el Antígeno   de Membrana del Anillo (RIMA, del inglés ring membrane antigen) y dos proteasas   parecidas a Subtilisina (SUB-1 y SUB-2, del inglés subtilisin-like porteases),   siendo estas las más relevantes en la invasión y en el diseño   de vacunas15.
Todas estas proteínas   juegan un papel esencial para entender los mecanismos de invasión del parásito   en las células del hospedador, y están involucradas tanto en el movimiento   de desplazamiento del esporozoíto, como en la rápida penetración   del merozoíto y en la interacción receptores-ligandos en la superficie   del parásito hasta  la formación de la VP.
  
Proteínas   implicadas en el reconocimiento e invasión del hepatocito por el esporozoíto     
El esporozoíto   es el estadio con mejor adaptación ya que se puede encontrar en diferentes   hospedadores y tipos de células. El esporozoíto de Plasmodium   es móvil y presenta un movimiento característico en espiral descrito   por varios investigadores llamado "Deslizamiento" (glinding motility en inglés).   Este movimiento requiere de microfilamentos y es esencial para la invasión16.    
En este   proceso de invasión, la proteína CSP es esencial y se encuentra en   mayor proporción en la superficie del parásito por medio de un anclaje   tipo glicosil fosfatidil inositol (GPI, del inglés glycosil phosfatil inositol)   a la membrana del esporozoíto. Esta CSP es expresada desde el estadio de   ooquiste dentro del vector y presenta una secuencia repetida de amino ácidos   (NANP), que fue usada en el primer ensayo de vacuna para malaria17,18. Varios investigadores han demostrado que la CSP está presente en   el citosol de los hepatocitos cuando se incuban con esporozoítos 4. Esta   proteína contiene una copia de la proteína trombospondina (TSP)    tipo I de humano y es translocada a la superficie por un proceso dependiente   de actina16.
El parásito   en las glándulas salivares del vector inicia la expresión de las proteínas   TRAP y CSP. La TRAP se localiza en los micronemas y es secretada sobre la superficie   del parásito. Esta proteína contiene una estructura con una secuencia   señal de amino ácidos  hidrofóbica la cual ha sido encontrada   en algunas integrinas (región II), es rica en prolina y presenta una cola   hidrofílica citoplasmática19. Experimentos de inmunofluorescencia   con anticuerpos han demostrado que en el momento de la invasión hay una   relocalización de la proteína TRAP sobre el parásito concentrándose   en un extremo en forma de capuchón20 Sin embargo, TRAP parece   no ser determinante en la invasión y presenta una función primordial   en el proceso de adhesión ya que reconoce a la molécula de heparin   sulfato (HS) de los hepatocitos. La CSP como la TRAP, reconoce diferentes tipos   específicos de proteoglicanos (HSPG, del inglés highly sulfated heparin   sulfate proteoglycans) en la superficie celular de las células de Kupffer,   células estrelladas y hepatocitos; pero no del endotelio sinusoidal21.    
Noe y Adams22,   demostraron por confocalidad que la proteína de Membrana Apical Antígeno/Unida   al Eritrocito (MAEBL, del inglés apiacal membrane antigen/erythrocyte binding-like   protein), localizada en las roptrias, se expresa junto con las proteínas   roptrias 1 y 2 (RAP 1 y RAP 2, del inglés rhoptry associated protein 1   and 2) involucradas en el proceso de invasión. Esta proteína es expresada   relativamente temprano en el desarrollo del esquizonte, apareciendo sobre la   superficie del merozoíto; su función todavía no ha sido aclarada.    
Cuando el esporozoíto   entra al torrente sanguíneo es capaz de penetrar en el hepatocito induciendo   la invaginación de la membrana plasmática (MP) y la formación   de la VP para multiplicarse en el interior de la célula del hospedador.    
La pregunta lógica   que se hicieron los investigadores que estudian los mecanismos de invasión   del esporozoíto después de dilucidar los procesos de adhesión   entre las células parásito-hospedador, fue: ¿cómo migra   el esporozoíto desde el vaso sinusoidal al hepatocito?
Se sabe que existe   un marcado tropismo entre el esporozoíto y el hepatocito que esta cubierto   por HSPGs del tipo HS, los cuales son abundantes en la matriz extracelular de   los hepatocitos y estos a la vez tienen interacción con la CSP23,   24. La CSP también reconoce a las HSPGs de las células de Kupffer   y estrelladas que están en el espacio de Disse. Uno de los  modelos   planteados es que el esporozoíto es arrastrado desde el vaso sanguíneo   sinusoide hacia la matriz extracelular y a las células de Kupffer, residentes   de los vasos sinusoides, por la unión establecida con los HSPGs  y   de esa forma atraviesa la barrera de la célula sinusoidal25, 26.   Pradel y Frevert en el 2001 25, demostraron que el esporozoíto   pasa primero por la célula de Kupffer y luego al hepatocito, lo que sugiere   que la célula de Kupffer presenta actividad fagocítica actuando como   un transportador del esporozoíto.
Pradel y colaboradores21,   proponen otro modelo para explicar la invasión del hepatocito por el esporozoíto,   sugiriendo que los esporozoítos se unen a los HPSGs que están proyectados   hacia el espacio de Disse de la matriz extracelular y atraviesan el endotelio   fenestrado siendo arrastrados desde el sinusoide al hepatocito. En la figura   3, se presenta un modelo de cómo los HSPGs de la superficie de las   células de Kupffer intervienen en el proceso de migración de los esporozoítos   por medio de un mecanismo  de extravasión celular donde el parásito   penetra al parénquima de la célula hepática. La teoría mas   aceptada hoy en día es que la invasión esta mediada por las células   de Kupffer que actúan como transportadora.


Proteínas   del merozoíto implicadas en el reconocimiento e invasión al eritrocito   
Tanto el esporozoíto   como el merozoíto presentan un complejo apical que secreta su contenido   durante la invasión a las células del hospedador (Fig.   2).  Los mecanismos de invasión del merozoíto al eritrocito   no están completamente dilucidados. Se ha establecido que la invasión   del merozoíto es un proceso muy rápido de aproximadamente 20 segundos   con una secuencia de eventos que se pueden resumir en 4 pasos: (1) contacto   del merozoíto con el eritrocito por cualquier parte de la superficie del   parásito; (2) orientación del extremo apical hacia la membrana del   eritrocito; (3) ataque del complejo apical  desplazándose dentro de   la célula hospedadora y la unión entre las membranas de ambas células;   (4) proceso de internalización del merozoíto por el  motor actina/miosina   y al mismo tiempo la formación de la VP12.
Este complejo   apical juega un papel esencial en la invasión, ya que el contenido de las   roptrias y micronemas es secretado promoviendo una fuerte unión  entre   la superficie del merozoíto y la membrana del eritrocito27.   Esta unión genera una fuerza de penetración mediada por la interacción   de las moléculas de actina/miosina del citoesqueleto del parásito   y algunas proteínas de la superficie del eritrocito, resultando como producto   final del proceso, la formación de la VP donde reside el parásito   para multiplicarse asexualmente 28. La VP actúa como una barrera   semipermeable entre el parásito y el eritrocito permitiendo la adquisición   de nutrientes y secreción de proteínas derivadas del parásito.   Por lo tanto, la esquizogonia eritrocítica es la parte del ciclo de vida   del parásito donde se inicia el desarrollo de estructuras en el eritrocito   anucleado hasta formarse el esquizonte maduro con la consecuente liberación   de nuevos merozoítos 29(Fig. 1).
Muchas proteínas   del merozoíto están involucradas en este proceso, pero muy poco se   sabe de su papel en la invasión. En la siguiente tabla presentamos algunas   de las proteínas más estudiadas para el diseño de vacunas aunque   no están todas ya que cada día se reportan nuevas cantidades en busca   de una respuesta inmunologíca efectiva  (Tabla).   Entre las proteínas involucradas la MSP-1 está relacionada en la interacción   inicial con el eritrocito30,31. Esta proteína está unida   a la superficie del merozoíto por un anclaje tipo GPI, al igual que las   MSP-2, MSP-4 y MSP-532-34. La MSPs son un complejo de proteínas   que sufren varios procesos proteolíticos como la MSP-1 dando una serie   de polipéptidos, y siendo el péptido de 19 kDa el que permanece unido   a la MP del parásito por su extremo carboxílico. Recientemente se   han descrito dos proteasas la SUB-1 y 2 que han sido localizadas en los gránulos   densos y han sido postuladas como las responsables del clivaje de la MSP-1 en   la invasión35.



La proteína   denominada AMA1, una proteína integral de membrana, se localiza inicialmente   en el cuello de las roptrias y, después de la ruptura del esquizonte, se   localiza en la superficie del parásito y su función no ha sido determinada29,   36.
Otra proteína   secretada por los gránulos densos es la RIMA de 14 kDa en P. falciparum.   Esta proteína cuya función no ha sido completamente dilucidada, es   expresada en el equizonte tardío y en los merozoítos libres y está   localizada sobre la membrana de las nuevas formas de anillo justo después   de la invasión, la función no ha sido dilucidada37.
En las roptrias,   además de la AMA 1 se han identificado varias proteínas, (Proteínas   Asociadas a Roptrias 1 y 2, RAP 1 y RAP 2; y otra menos estudiada RAP-3) formando   un complejo, las cuales pueden estar involucradas en la invasión y han   sido observadas en la VP en el proceso de penetración al eritrocito10,   38,39,40. Las RAP 1 y 2 fueron aisladas por primera vez en merozoítos   de P. knowlesi como una molécula de 66 kDa y fueron las primeras   proteínas secuenciada en roptria y localizadas en el conducto de la organela41.    
La proteína   antigénica  unida al Eritrocito (EBA-175, del inglés erythrocyte   binding antigen 175),  se ubica en los micronemas y se une a la molécula   de Glicoforina A por medio de ácidos siálicos, los cuales generan   una carga negativa y por lo tanto está relacionada en el contacto inicial   entre el parásito y el eritrocito42-44. Otra proteína llamada   EBA-140 (también conocida como BAEBL) ha sido identificada en la invasión,   uniéndose a la molécula de Glicoforina C del eritrocito45,46.   Estos hallazgos indican que las moléculas de Glicoforinas A, B y C de la   superficie del eritrocito están presentes en relativa abundancia y son   los receptores que median el contacto inicial con el parásito.
En el parásito   sólo cuatro proteínas localizadas en los gránulos densos del   complejo apical han sido identificadas, siendo  el antígeno de superficie   del eritrocito en forma de  anillo infectado (RESA, del inglés ring-infected   erythrocyte surface antigen,) el más relevante como candidato a vacuna.   Esta proteína es secretada al mismo tiempo que ocurre la invasión,   translocándose a través de la membrana de la VP y localizándose   bajo la membrana del eritrocito parasitado en asociación con el citoesqueleto37,47.   Esta se expresa en el esquizonte tardío y es almacenada en la organela   hasta la invasión cuando es liberada.
P. vivax   , la otra especie del parásito que es responsable de las manifestaciones   clínicas graves en el humano, además de presentar las proteínas   antes mencionadas que están conservadas en todas las especies,  invade   a los reticulocitos (eritrocitos inmaduros), los cuales presentan  un grupo   de moléculas llamadas receptores Duffy o antígenos Duffy  unidas   a otras proteínas denominadas proteínas similares a las unidas a Duffy   (DBP, del inglés Duffy bindind protein) presentes en las roptrias del merozoíto45.   La población negra no presenta infecciones por P. vivax porque sus   eritrocitos carecen de estos receptores. La familia de proteínas DBL y   las proteínas   de 235 kDa localizadas en micronemas y roptrias   respectivamente intervienen en la selección del tipo de eitrocito a invadir   por el merozoíto. Sin embargo otros estudios en modelos experimentales   con ratones han mostrado que la MSP-749 y la MSP-850 están   involucradas en la selección de los eritrocitos  a invadir.
Las proteínas   involucradas en los mecanismos de invasión del parásito  en sus   diferentes estadios infectantes y sus modificaciones, son estrategias empleadas   para cito-adherirse a diferentes tipos de células  hospedadoras y   multiplicarse en ellas. Los conocimientos de estas proteínas pueden ser   utilizados en el desarrollo de fármacos y en el diseño de vacunas   antimaláricas.
Conclusiones   
El estadio inicial   de malaria incluye la migración de los esporozoítos de la piel al   hígado, la invasión de los hepatocitos y subsecuentemente el desarrollo   del parásito al estadio de merozoíto. Estos pasos obligatorios para   establecer una infección exitosa en el hospedador vertebrado involucran   una serie de proteínas que son esenciales en los mecanismos de invasión   del Plasmodium a las células del hospedador como son las proteínas   parecidas a Subtilisina (SUB-1 y SUB-2), RESA, CSP, TRAP y las MSPs. La aplicación   lógica de estos conocimientos es una herramienta básica para la selección   de una o unas proteínas candidatas a vacuna y control terapéutico   para la enfermedad, por lo que se requiere un profundo entendimiento de los   complejos moleculares y los procesos que están relacionados en la invasión   celular en malaria.
  
Agradecimientos   
Le agradecemos   al  Decanato de Investigación y Desarrollo de la Universidad Simón   Bolívar (DID-USB) por apoyar la búsqueda de información para   la realización de este artículo. Nosotros nos disculpamos con los   investigadores que trabajan en esta área y no han sido citados en este   trabajo por límite de espacio. También queremos agradecerle a Alberto   Louro por su crítica revisión del manuscrito.
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Recibido: 15 de   marzo de 2016.
Aprobado: 30 de abril de 2016.

1 Departamento de Ciencias de la Vida y Biotecnología. Universidad Yachay Tech, Imbabura, Ecuador.
2 Universidad de Venezuela. Departamento de Biología Celular de la Universidad Simón Bólivar, Caracas-Venezuela.
3 Universidad de Granada, España.  
4 Universidad Nacional Experimental Rómulo Gallego, Escuela Veterinaria, núcleo Zaraza, Venezuela.

Correspondencia: Lilian M. Spencer. Profesora del Departamento de Ciencias de la Vida y Biotecnología en Yachay Tech. E-mail: spencerlilian@gmail.com; lspencer@yachaytech.edu.ec
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