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2018.03.03.5

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INVESTIGATION / RESEARCHS
 
Efecto del carbón activado en la germinación y brotación in vitro de Citrus limon (L.) y su dinámica de crecimiento
Effect of activated charcoal on in vitro germination and shoot multiplication of Citrus limon (L.) and its growth dynamics

 
Ivonne Vaca 1, Miguel Marulanda2, Joana Verdesoto2, Alejandro Núñez2, Ramiro Daniel Acurio1, Viviana Chiluisa-Utreras1
Available from: http://dx.doi.org/10.21931/RB/2018.03.03.5


ABSTRACT

Tissue culture of Citrus limon has focused on the influence of growth regulators for their propagation. In the present study, the evaluation of the culture medium supplemented with activated charcoal presented better results than the addition of plant growth regulators. The in vitro culture of C. limon in Murashige and Skoog (MS) medium added with activated charcoal (1 g.L-1), allowed to get favorable results in days after germination and shoot multiplication. In addition, the curves were generated for germination (introduction phase), stem length, number of shoots per plant, number of leaves per plant and leaf length (multiplication phase), these parameters allows to follow the growth dynamics. Finally, the correlation of the increase in the number of shoots and stem length was determined.
Keywords: activated charcoal, growth curves, germination, lemon



RESUMEN
Los estudios de cultivo de tejidos en Citrus limon, se han enfocado en la influencia de reguladores de crecimiento para su propagación. En la presente investigación se realizó la evaluación de la adición de carbón activado en el medio de cultivo, obteniendo mejores resultados que investigaciones sobre adición de fitoreguladores. El cultivo in vitro de C. limon en medio Murashige and Skoog (MS) adicionado con carbón activado (1 g.L-1), permitió obtener resultados favorables en las variables días a la germinación y brotación. Además, se generó las curvas para las variables germinación (fase de introducción), longitud de tallo, número de brotes por planta, número de hojas por planta y longitud de la hoja (fase de multiplicación), lo que permite seguir su dinámica de crecimiento. Finalmente, se determinó la correlación del incremento del número de brotes y la longitud de tallo.
Palabras clave: carbón activado, curvas de crecimiento, germinación, limón


INTRODUCCIÓN

Citrus limon (L.), cuyo nombre común es limón o limonero, es un híbrido natural que presenta una gran cantidad de variedades, el fruto tiene diversas aplicaciones, el zumo tiene alto contenido de ácido cítrico y del epicarpo se obtiene la esencia1. Recientes trabajos sobre C. limon, reportan altos contenidos de compuestos fenólicos en la corteza, que son responsables de las características antioxidantes de la pulpa, también informan que estos compuestos protegen el ADN contra la rotura por efecto de radicales libres y además tiene propiedades antibacterianas2. Todas las cualidades del limón, lo convierten en una planta de alto interés científico en diferentes áreas, por lo que el estudio de su propagación y la dinámica de su crecimiento, son un punto clave para facilitar su producción.

La mayoría de estudios de cultivo in vitro de limón se han enfocado en reguladores de crecimiento; el presente estudio propone la adición de carbón activado en el cultivo de tejidos, ya que tiene un efecto positivo sobre el crecimiento de las plantas, tiene la capacidad de atrapar diferentes tipos de moléculas, sustancias en exceso, entre estos los inhibidores de crecimiento3. La capacidad de adsorción se debe a su fina red de poros y su amplia área interna, esto conlleva a favorecer a diferentes procesos de morfogénesis; además, se plantea la posibilidad que el carbón activado pueda ir liberando lentamente alguno de los reactivos adsorbidos4, favoreciendo su respuesta en el cultivo de tejidos.
 
 
La dinámica de crecimiento, representado en las curvas de crecimiento reflejan el comportamiento de la planta en un ambiente particular, en relación al tiempo5, lo que en el cultivo in vitro permite dar seguimiento a las condiciones óptimas del mismo, como respuesta a diferentes factores de evaluación, en este caso las curvas permiten señalar las características de la vitroplanta [IV1] durante la fase de multiplicación.
 
MATERIALES Y MÉTODOS
 
Desinfección del material vegetal
 
Para el cultivo in vitro de limón se seleccionaron frutos maduros, de los cuales se obtuvo la semilla. Se realizó una desinfección de los explantes con alcohol al 70%, durante 1 minuto, posteriormente se sumergieron en una solución de hipoclorito de sodio al 20% (v/v) más una gota de tween, durante 20 minutos. Se realizaron tres enjuagues con agua destilada estéril previo a la siembra.

Evaluación del efecto del carbón activado en el cultivo in vitro
 
Las semillas ya desinfectadas fueron sembradas en medio de cultivo Murashige y Skoog (MS) suplementado con sacarosa al 3% y un pH de 5,7.  En la presente fase se evaluó el efecto del carbón activado en el medio de cultivo (1g.L-1) y su correspondiente testigo (sin carbón activado). Posteriormente los explantes fueron incubados en el cuarto de crecimiento a 22 +2ºC, durante ocho semanas para su evaluación.
 
Las variables evaluadas fueron: porcentaje de germinación y número de brotes. Además se determinó los días a la germinación, definidos como los días a la emergencia de la radícula, tomados desde el momento de la siembra, hasta cuando cada tratamiento presentó 50% (primera fecha) y 75% de germinación (segunda fecha). Los datos de cada variable fueron sometidos a un análisis de varianza ADEVA y se realizó la prueba de Duncan al 5%, para los factores en estudio que presentaron diferencias significativas, empleando el software InfoStat. Mediante el seguimiento continuo se desarrolló la curva de germinación de las semillas.
 
Curvas de crecimiento durante la fase de multiplicación  
 
Las plántulas obtenidas en la fase de introducción, fueron transferidas a un medio MS suplementado con sucrosa (30 g.L-1). Para la siembra en el medio de multiplicación, se eliminaron los cotiledones y radícula, se segmentaron explantes de 12mm de longitud aproximadamente. Durante la multiplicación se realizó un seguimiento continuo del crecimiento de los explantes provenientes de la siembra con carbón activado, por seis semanas.
Las  variables evaluadas para las curvas de crecimiento durante la fase de multiplicación fueron: Longitud del tallo, Promedio de brotes por planta, Número de hojas, Promedio de longitud de las hojas. Se aplicó una regresión logarítmica sobre las variables longitud del tallo y promedio de brotes por planta.
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Evaluación del efecto del carbón activado en el cultivo in vitro

En la evaluación del efecto del carbón activado en el medio de cultivo, se encontró que para el porcentaje de germinación y días a la germinación (p>0,05) no hay diferencias, mientras que para el número de brotes presenta diferencia significativa (p=0,0013).

Germinación y brotación

La adición de carbón activado al medio de cultivo resultó en un efecto positivo, para el desarrollo de plantas de C. limon. Tanto la germinación como el número de brotes por planta, fueron mayores en el medio de cultivo adicionado con carbón activado, mientras que los días a la germinación disminuyeron (Tabla 1).



Tabla 1. Promedios de germinación, días a la germinación y número de brotes del C. limón durante la introducción al cultivo in vitro
 
 
El  promedio del número de brotes por planta, fue tres veces mayor en el medio de cultivo adicionado con carbón activado (M1), lo que puede atribuirse a su capacidad de adsorción de sustancias inhibitorias, reguladores de crecimiento o componentes orgánicos, y puede liberar las sustancias de crecimiento previamente adsorbidas por el mismo carbón activado6; de esta manera la planta tendrá una fuente a largo plazo del reactivo, favoreciendo su respuesta en el cultivo in vitro. El carbón activado puede adherir en su superficie una gran diversidad de moléculas (capacidad de adsorción) ya que posee una estructura porosa, elevada área superficial y alta concentración de sitios activos7. Confirmando los resultados obtenidos en la presente investigación, se encontró mayor elongación de brotes y raíces en presencia de carbón activado, en el cultivo in vitro de Solanum sessiliflorum var. Thais 8.

Curva de germinación

A pesar de no encontrar diferencias significativas en el porcentaje de germinación y los días a la germinación, se puede destacar que los explantes expuestos a Carbón activado (M1) llegaron al 50 y 75% (Fecha 1 y Fecha 2, respectivamente) dede germinación varios días antes que el testigo (M0) (Tabla 1).

En M1 (MS+CA) se obtuvo el 100% de germinación a los 42 días (6 semanas), mientras que para M0 (MS) a las 8 semanas llegó cerca del 92% (Figura 1), lo que indica que el carbón activado aceleró el proceso de germinación en las semillas. El carbón activado puede actuar como catalizador de reacciones químicas7, favoreciendo por ejemplo los procesos de respiración de la semilla para su germinación. Singh et al.9, sugieren que el carbón activado facilita la capacidad de penetración de la testa, favoreciendo el contacto del agua y oxígeno con las células, dando como resultado mayor germinación de las semillas; en Solanum lycopersicum y Vigna radiata, los tratamientos con carbón activado favorecieron a la germinación, debido a una mejor absorción de dióxido de titanio. Existen reportes positivos en diferentes especies, respecto a la germinación en semillas expuestas a carbón activado, entre ellas Hyophorbe lagenicaulis, Dendrobium nobile, Ophrys sp., Disa spp., Brassica napus, Vitis vinífera; además se indica que el carbón activado favorece en procesos de embriogénesis somática, maduración y germinación, en diferentes sistemas4.

 
 
 
Figura 1. Curva de germinación del C. limon durante la introducción al cultivo in vitro.

Curvas de crecimiento de la fase de multiplicación

Respecto a la multiplicación a los segmentos de yema sembrados en el medio de multiplicación, se encontró que la longitud del tallo principal incrementó un 77,1%, en seis semanas de evaluación, pasando de 11,8 a 20,9 mm  (Figura 2A), de igual manera el número de brotes incrementó en un 56,8% (Figura 2B).

Varios estudios realizados sobre micropropagación en C. limon han sido reportados en relación a reguladores de crecimiento, sin embargo el índice de multiplicación no ha superado los 3 brotes/planta en medio MS + BAP (2mg.L-1)10, contrario al promedio de número de brotes alcanzado en el presente estudio de 4 brotes/planta en 42 días (Figura 2B).
 

 
Figura 2. 2A: Curva de crecimiento del promedio de la longitud del tallo de la vitroplanta. 2B: Curva de crecimiento del promedio del número de brotes por planta. 2C: Curva de crecimiento del promedio de número de hojas por planta. 2D: Curva de crecimiento del promedio de la longitud de las hojas.
 
Quoirin, Da Silva, Martins, & De Oliveira11, reportan que la adición de carbón activado (2g.L-1) al medio de cultivo (75% sales MS), en la fase de multiplicación de Acacia mearnsii, favoreció en la elongación de los brotes y disminuyó la clorosis, resultados similares a los obtenidos en el presente estudio; concuerdan también con la revisión de Thomas4, que indica que el algodón (Gossypium hirsutum) cultivado con carbón activado, favoreció a la brotación y longitud de brotes.

En seis semanas de evaluación el número de hojas incrementó en un 66,7% (2,59 a 4,32), y la hoja duplicó su longitud, con un crecimiento del 101,2% desde 5,16 a 10,42 mm. Además, se puede resaltar que el número de hojas tuvo su mayor incremento en las dos primeras semanas, con un promedio de 1,09 hojas. Los resultados de la presente investigación concuerdan con el estudio de Brassia verrucosa, que reporta efectos positivos sobre la longitud de hoja, cuando se cultivó en medio de cultivo suplementado con carbón activado y peptona12. Además, el crecimiento de la hoja pudo verse favorecido también, por la densidad de siembra (1 planta por contenedor), ya que le provee suficiente espacio al interior del frasco y favorece al paso de la luz.
 
Correlación del incremento del número de brotes  y la longitud de tallo.

Después de probar con varios modelos de correlación, se ha establecido que el incremento en el número de brotes en relación a la longitud del tallo es descrito matemáticamente como una función que se ajusta mejor a una regresión logarítmica (Figura 3), con un coeficiente de determinación R2=0,997. La ecuación resultante fue Y = 5,154Ln(X) + 11,811, donde Y es la longitud del tallo (mm) y Ln(X) el logaritmo natural del número de brotes por planta.


 
Figura 3. Curva y ecuación de regresión logarítmica (logaritmo natural) entre la longitud del tallo y el número de brotes por planta.
 
 
La relación entre el índice de multiplicación representado por el promedio de número de brotes por planta y la longitud del tallo, fue positiva y se ajustó a una curva de regresión logarítmica, misma que sugiere que a mayor longitud del tallo de C. limon habrá un mayor número de brotes. Información que concuerda con los datos reportados para Rubus glaucus, que a mayor longitud (2,18 cm) se contabilizaron mayor número de brotes (5,27)13.

La figura 3 muestra que el incremento en la longitud del tallo fue menor conforme avanzaron las observaciones semanales, empezando con  un incremento de 3,59 mm de la primera semana y terminando con 0,84 mm en la última semana; esto relacionado con el número de brotes, permite suponer que los entrenudos fueron cada vez más cortos; lo que favorece al índice de multiplicación, evaluado como el número de yemas (nudos) por planta (14).
 
CONCLUSIONES
 
La adición de carbón activado (1g.L-1) en el cultivo in vitro de Citrus limon permite reducir los días a la germinación e incrementar el número de brotes obtenidos por planta. Las curvas de crecimiento obtenidas permitieron concluir que el mayor incremento de longitud de tallo, número de brotes por planta, número de hojas por planta y longitud de la hoja se da durante las primeras semanas de cultivo. Además se determinó una regresión logarítmica (R2=0,997), para el número de brotes en relación a la longitud del tallo.
 
 
REFERENCIAS
 
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Recibido: 29 mayo 2018
 
Aceptado: 4 agosto 2018
 
 
Ivonne Vaca 1, Miguel Marulanda2, Joana Verdesoto2, Alejandro Núñez2, Ramiro Daniel Acurio1, Viviana Chiluisa-Utreras1
 
1Grupo de Investigación BIOARN. Universidad Politécnica Salesiana. Quito, Ecuador. 2Universidad Politécnica Salesiana, Carrera de Ingeniería en Biotecnología de los Recursos Naturales.
 
 
Autor por correspondencia: ivaca@ups.edu.ec, ivonne.vaca@gmail.com,
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