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Latin American Journal of Biotechnology and Life Sciences
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2021.06.04.13
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INVESTIGATION / RESEARCH

Micropropagación in vitro de naranja agria (Citrus aurantium L.) a partir de segmentos nodales
In vitro micropropagation of sour orange (Citrus aurantium L.) from nodal segments

Angel David Hernández-Amasifuen, Alexandra Jherina Pineda-Lázaro *, Hermila Belba Díaz-Pillasca
Available from: http://dx.doi.org/10.21931/RB/2021.06.04.13

 
RESUMEN

 
La naranja agria (Citrus aurantium L.) presenta un alto valor nutricional y gastronómico en el distrito de Huacho, Lima, Perú, pero en la actualidad se considera una especie en peligro de desaparecer del distrito y alrededores por problemas fitosanitarios. Para la recuperación y repoblación de esta especie se planteó emplear técnicas biotecnológicas para la obtención de plantas libres de patógenos. Por lo tanto, el objetivo de la presente investigación fue micropropagar in vitro naranja agria a partir de segmentos nodales. Los segmentos nodales de naranja agria fueron desinfectados en diferentes concentraciones de NaClO, luego se introdijeron en medio de cultivo MS (Murashige y Skoog) adicionado con BAP, KIN y AG3 para la fase de multiplicación, posteriormente se transfirieron a medios MS adicionado con IBA y ANA para la fase de enraizamiento. La evaluación del porcentaje de contaminación se realizó a los diez días, la evaluación de formación de brotes en fase de multiplicación se realizó a los 30 días y la evaluación de enraizamiento a los 30 días. En la fase de desinfección y establecimiento in vitro se logró obtener 0% de contaminación y 0% de oxidación de los explantes. En la fase de multiplicación in vitro los mejores resultados se obtuvieron en el medio de cultivo M8 generando 4,7 brotes por explante. Y finalmente en la fase de enraizamiento el medio E4 permitió obtener 94,7% de explantes enraizados, 23,4 mm de longitud de raíz y 2,2 raíces por explante.
 
Palabras Claves: desinfección, establecimiento, multiplicación, biotecnología, Huacho.

 
 
ABSTRACT

 
Sour orange (Citrus aurantium L.) has a high nutritional and gastronomic value in Huacho, Lima, Peru, but is currently considered a species in danger of disappearing from the district and surrounding areas due to phytosanitary problems. For the recovery and repopulation of this species, biotechnological techniques were proposed to obtain pathogen-free plants. Therefore, the objective of the present research was to micro propagate sour orange in vitro from nodal segments. Sour orange nodal segments were disinfected in different concentrations of NaClO, then placed in MS culture medium (Murashige and Skoog) supplemented with BAP, KIN, and AG3 for the multiplication phase, and then transferred to MS medium supplemented with IBA and ANA for the rooting phase. The evaluation of the percentage of contamination was carried out after 10 days, the evaluation of shoot formation in the multiplication phase was carried out after 30 days, and the evaluation of rooting after 30 days. In the disinfection and in vitro establishment phase, 0% contamination and 0% oxidation of the explants were obtained. In the in vitro multiplication phase, the best results were obtained in the M8 culture medium, generating 4.7 shoots per explant. Finally, the E4 medium yielded 94.7% of rooted explants, 23.4 mm root length, and 2.2 roots per explant.
 
Keywords: disinfection, establishment, multiplication, biotechnology, Huacho.
 
 
INTRODUCCIÓN

 
Los cítricos (Citrus) son un importante género de árboles frutales por presentar un alto valor nutricional y económico, encontrándose ampliamente distribuido por todo el mundo debido a su gran consumo1,2. Con una producción de 124 millones de toneladas en promedio anualmente a nivel mundial, mientras que en Perú solo se llega a producir un millón de toneladas, de los cuales alrededor del 40% es producido por naranjas3,4.
 
Dentro de las naranjas que produce el país se tiene a la naranja agria o amarga (Citrus aurantium L.), la cual es utilizada en la gastronomía, como saborizante, en la medicina natural y como portainjerto de gran número de especies de valor comercial, por presentar resistencia a condiciones abióticas como salinidad y sequía, además de ser tolerante a fitopatógenos como Armillaria mellea y Phitophthora sp.5. Es así como se puede encontrar a la naranja agria dentro de la biodiversidad vegetal del distrito de Huacho, Provincia de Huaura, Departamento de Lima. La cual es utilizada como insumo para muchos platos típicos de la zona como el ceviche de pato y ceviche de pescado, pero actualmente su producción es escasa, al punto de encontrar números reducidos de estos árboles frutales por lo que esta próxima de desaparecer del distrito y sus alrededores6,7, esto debido a ser susceptible al virus de la tristeza de los cítricos (CTV), ocasionando escasa longevidad de las plantas, bajos rendimientos y deficiencias de calidad de la fruta8,9, y además la preferencia de los agricultores locales a otros cultivos de mayor demanda económica10,11.
 
Considerando a la naranja agria como una planta de gran importancia gastronómica a nivel local y nacional, se busca estrategias para la recuperación y repoblación de esta especie. En la actualidad se pueden aplicar herramientas de biotecnología vegetal, como el cultivo in vitro de tejidos vegetales12,13. Resultando en clones uniformes a partir de una planta madre libre de enfermedades y de gran producción, conservando y garantizando los rasgos seleccionados14. Además, la propagación in vitro permite obtener material vegetal durante todo el año, de esta manera no habría un limitante como el suministro de semilla o plantines de invernaderos15,16.
 
En tal sentido las aplicaciones de los cultivos in vitro no solo se limitan a las altas tasas de multiplicación como método de propagación asexual para la producción de plantas clonales, sino que también forma la base para gran variedad de estudios en la mejora genética vegetal17. Es así como se han reportado investigaciones en el cultivo in vitro de cítricos, donde se ha evaluado las diferentes respuestas morfogenéticas influenciadas por la especie, tipo de explante y la composición del medio de cultivo18,19. Iniciando desde el establecimiento in vitro de semillas de naranja dulce (Citrus sinensis L.) y su posterior multiplicación a partir de segmentos maduros del tallo20. De la misma manera 21, trabajaron inicialmente con semillas de naranja agria y lima (Citrus aurantifolia) respectivamente, para luego multiplicar a las plántulas germinadas empleando diferentes concentraciones de reguladores de crecimiento. 22, trabajo con semillas de naranja y con varetas de limón, logrando establecer in vitro a ambas especies para realizar microinjertos, evaluando la influencia de las concentraciones de sacarosa en el medio de cultivo. 23, realizaron experiencias con yemas de limón criollo (Citrus limon), para la formación de callos y brotes empleando picloram y ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). 24, trabajaron en la micropropagación de limón a partir de segmentos nodales. 25, evaluó el efecto de las citoquininas 6-Bencilaminopurina (BAP) y kinetina (KIN) en la propagación in vitro de lima (Citrus aurantifolia) a partir de segmentos nodales. 26, establecieron un protocolo de micropropagación de citrumelo “Swingle” a partir de segmentos nodales, y lograron obtener tasas aceptables de multiplicación. 27, evaluaron varias concentraciones de reguladores de crecimiento (citoquininas, auxinas y ácido giberélico) en el medio de cultivo MS para inducir la formación de brotes a partir de segmentos nodales de naranja agria y mandarina.
 
Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue lograr la micropropagación in vitro de naranja agria a partir de segmentos nodales, estableciendo un protocolo óptimo de propagación efectiva para la obtención de una fuente ideal de material aséptico y homogéneo para usar en programas de mejoramiento genético vegetal.
 
 
 
MATERIALES Y MÉTODOS

 
La investigación se realizó en el Laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Escuela Profesional de Biología con mención en Biotecnología, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión, en el distrito de Huacho, provincia de Huaura, departamento de Lima, Perú.
 
 
Material vegetal
 
Se emplearon segmentos nodales de naranja agria procedentes del vivero que pertenece al Laboratorio de Biotecnología Vegetal, ubicada en la ciudad universitaria de la Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión; situado a una altitud de 41 msnm, latitud sur 11° 7’ 34” y longitud oeste 77° 36’ 34”, con temperatura media anual de 19,2° C.
 
 
Desinfección y establecimiento in vitro de segmentos nodales
 
Los segmentos nodales fueron llevados a laboratorio donde se lavaron con agua destilada durante 5 minutos y se continuo se inició con el proceso de desinfección. Se trasladaron a cámara de flujo laminar y se sumergieron en etanol al 70 % durante 1 minuto, después fueron sumergidos durante 5 minutos en solución de hipoclorito de sodio (NaClO) al 1%, seguido se sometieron a cuatro tratamientos con variaciones en las concentraciones de hipoclorito de sodio: 1% (T1), 1,5% (T2), 2% (T3) y 2,5% (T4) durante 10 minutos cada uno en agitación continua y luego se realizaron tres enjuagues en agua destilada estéril para eliminar los residuos de hipoclorito de sodio, seguido los segmentos nodales se cortaron por la parte inferior y superior hasta tener un explante de aproximadamente 1.5 cm de longitud. Finalmente fueron introducidos in vitro en tubos con medio de cultivo MS26 a la mitad de su concentración, adicionado con 6 g/L de agar, 15 g/L de sacarosa y pH a 5,7. El medio de cultivo empleado fue previamente esterilizado en autoclave a 1,2 Bar de presión y una temperatura de 121° C durante 20 minutos.
 
 
Multiplicación in vitro
 
A los 30 días se realizaron cortes para obtener nuevamente segmentos nodales, los cuales fueron cultivados in vitro en el medio de cultivo MS suplementado con reguladores de crecimiento en diferentes tratamientos (Tabla 1). El medio de cultivo fue preparado con sales y vitaminas del medio de cultivo MS adicionado con 7 g/L de agar, 23 g/L de sacarosa y se ajustó el pH a 5,7. El medio de cultivo fue dispensado en 10 mL por frasco y luego se sellaron con papel aluminio y fueron esterilizados en autoclave a 1,2 Bar de presión y una temperatura de 121° C durante 20 minutos.
 


 

Tabla 1. Combinación de los reguladores de crecimiento en el establecimiento in vitro de naranja agria (Citrus aurantium L.).
 
 
Enraizamiento in vitro
 
Transcurrido 30 días los explantes fueron transferidos a frascos que contenían medio de cultivo MS suplementado con auxinas en distintos tratamientos (Tabla 2). El medio de cultivo fue preparado con las sales y vitaminas del medio de cultivo MS adicionado con 7 g/L de agar, 23 g/L de sacarosa y se ajustó el pH a 5,7. El medio de cultivo fue dispensado en 10 mL por frasco y luego se sellaron con papel aluminio y fueron esterilizados en autoclave a 1,2 Bar de presión y una temperatura de 121° C durante 20 minutos.
 
En las tres etapas de evaluación (desinfección e introducción, multiplicación y enraizamiento) los explantes fueron incubados durante 30 días a una temperatura constante de 27° C, con humedad relativa del 75±2% y fotoperiodo de 16 horas luz con intensidad lumínica de 1500 Lux. (Plant Growth Chamber, LGC – 5201 G, LabTech)
 


 
Tabla 2. Combinación de las auxinas para el enraizamiento in vitro de naranja agria (Citrus aurantium L.).
         


 
Diseño experimental, variables medidas y análisis estadístico
 
Se empleó un diseño completamente al azar con 10 frascos por tratamiento, cada frasco contenía un explante como unidad experimental y el mismo se repitió tres veces. En la fase de desinfección e introducción se evaluó el porcentaje de contaminación, la oxidación de los explantes y la sobrevivencia, en la fase de multiplicación se evaluó el número de brotes, longitud de los brotes, numero de nudos y numero de hojas por explante y finalmente en la fase de enraizamiento se evaluó el porcentaje de explantes enraizados, longitud de la raíz y número de raíces. Los datos se procesaron mediante Análisis de Va­rianza (ANVA) con los paquetes estadísticos agricolae y car del programa libre R (versión 4.1.0 para Windows), y la comparación entre las medias se realizó de acuerdo a la prueba de Tukey (p ≤ 0.05).
 
 
RESULTADOS

 
Desinfección y establecimiento in vitro de segmentos nodales
 
La evaluación de la desinfección superficial de los segmentos nodales se realizó a los diez días después de realizada la introducción in vitro. La Tabla 3 muestra 0% de contaminación en los tratamientos T2, T3 y T4. La diferencia entre estos tratamientos se evidenció en el porcentaje de oxidación de los segmentos nodales, obteniéndose 0% de oxidación en los tratamientos T2 y T3.
 


 
Tabla 3. Efecto de la concentración de hipoclorito de sodio en la desinfección de los segmentos nodales de naranja agria (Citrus aurantium L.).
         

        

 
Multiplicación in vitro
 
La evaluación de los brotes se realizó a los 30 días de cultivo (Figura 1). En la Tabla 4 los resultados indicaron la influencia de combinar dos citoquininas (BAP y KIN) y AG3 en el tratamiento M8 lo que permitió obtener un mayor número de brotes (Figura 2). En el tratamiento M4 se obtuvo un promedio de longitud mayor a los demás tratamientos (Figura 3), mientras que en el promedio de número de nudos los tratamientos M4 y M6 fueron los que no presentaron diferencia significativa, y finalmente para el promedio de número de hojas los tratamientos M3 y M5 fueron los que presentaron los valores más altos, pero no difiriendo significativamente entre ellos.
 


 
                                               
 
Figura. 1. Plántulas in vitro de naranja agria (Citrus aurantium L.), a los 30 días de cultivo en la etapa de multiplicación.
 


 
Tabla 4. Efecto de los reguladores de crecimiento en el establecimiento in vitro de naranja agria (Citrus aurantium L.).
         

 

 
 
 
Figura 2. Efecto de la combinación de BAP, KIN y AG3 en el cultivo in vitro de naranja agria (Citrus aurantium L.), a los 30 días de cultivo.
 


 
 
 
Figura 3. Efecto del AG3 en el cultivo in vitro de naranja agria (Citrus aurantium L.), a los 30 días de cultivo.
 
 
Enraizamiento in vitro
 
La evaluación del enraizamiento se realizó a los 30 días de cultivo (Tabla 5), alcanzado los mejores resultados en el tratamiento E3 compuesto por el medio MS adicionado con 1 mg/L de IBA y 1 mg/L de ANA.
 


 
Tabla 5. Efecto en la combinación de las auxinas para el enraizamiento in vitro de naranja agria (Citrus aurantium L.).
         

 
DISCUSIÓN

 
Los tratamientos de desinfección de los segmentos nodales de naranja agria procedentes del invernadero permitieron su establecimiento en condiciones in vitro. Con las concentraciones de 1,5% (T2) y 2% (T3) de NaClO se obtuvieron explantes con 0% de contaminación y oxidación, por lo cual se les considera los mejores tratamientos. La desinfección del material vegetal en la presente investigación se inició con etanol al 70% y se continuo con soluciones de hipoclorito de sodio, es de gran importancia en la desinfección superficial de los explantes emplear etanol para eliminar contaminantes bacterianos y para los contaminantes fúngicos determinar concentraciones adecuadas de hipoclorito de sodio para no dañar el material vegetal29.
 
En la fase de desinfección y establecimiento in vitro, los tratamientos utilizados en la presente investigación presentan mejores resultados en comparación de otros autores que han trabajo con especies del mismo género, como 25, que utilizó hipoclorito de sodio al 0,6% durante 15 minutos para la desinfección de segmentos nodales de Citrus aurantiifolia, logrando un porcentaje de contaminación del 56%. Mientras que 23, lograron porcentajes de contaminación del 0% al emplear hipoclorito de sodio al 1% durante 20 minutos, pero además los autores utilizaron un segundo lavado transcurrida las 24 horas y adicionalmente los sumergió por una solución de sulfato de cobre al 2% en la desinfección de yemas apicales de Citrus limon.
 
En la multiplicación in vitro de los segmentos nodales de naranja agria el tratamiento con medio de cultivo MS suplementado con 0,25 mg/L KIN, 0,25 mg/L BAP y 0,25 mg/L AG3 permitió obtener el mayor número de brotes con 4,7 brotes por explante. Este resultado está en relación a la adición de los tres reguladores de crecimiento, mientras que en los demás tratamientos que se adicionaron dos reguladores de crecimiento se vieron significativamente afectados en la disminución del número de brotes por explante en comparación a los tratamientos donde solo se adiciono un regulador de crecimiento, coincidiendo con 26, quienes obtuvieron una disminución en la formación de brotes de citrumelo (Poncirus trifoliata (L.)  Raf. × Citrus paradisi McFaden) con tratamientos adicionando BAP y KIN, en comparación donde solo utilizaron BAP. Resultados similares obtuvo 25 quien no encontró diferencia significativa en el uso de BAP asociado con KIN que al utilizar únicamente BAP. Mientras que 27 emplearon un medio de cultivo MS suplementado con 2 mg/L de BAP y 0,6 mg/L de AG3 para la formación de brotes de naranja agria, donde obtuvieron dos brotes por segmento nodal, resultado muy cercano al obtenido con el tratamiento M6 en la presente investigación.
 
El tratamiento M4 fue el que presento mayor longitud de los brotes con 46.6 mm, esto es debido a que este medio de cultivo solo estaba suplementado con AG3. 30 señalan que en Citrus se utiliza generalmente AG3 para aumentar la longitud de los brotes. Pero al adicionar AG a los demás tratamientos con BAP y KIN no tuvo mayor efecto en la longitud de los brotes que en los tratamientos donde solo se adicionó una de las citoquininas. Estos resultados guardan relación con estudios realizados en evaluación del uso de BAP en adición con AG3 en Citrus aurantium 27 y Citrus limon31, donde concluyeron que no había diferencia significativa en comparación con los resultados obtenidos con los tratamientos donde solo se adicionó BAP en el medio de cultivo.
 
El mayor número de hojas se logró obtener con el medio de cultivo MS suplementado con 0,25 mg/L de KIN, con un promedio de 6,5 hojas por explante. Este resultado coincide con 23, quienes obtuvieron 6 hojas en promedio por brote al utilizar el medio MS adicionado con 0,25 mg/L de KIN. Además, se observaron hojas atrofiadas en los tratamientos con mayor número de brotes y combinación de reguladores de crecimiento, similar a lo obtenido por 27, que al utilizar el medio de cultivo con 2 mg/L de BAP combinado con 1 mg/L AG3 dieron lugar a nuevos explantes atrofiados con hojas estrechas e hiperhidricidad de naranja agria.
 
En la fase de enraizamiento el tratamiento E4 con medio MS al cual se le adicionó 1 mg/L de IBA y 1 mg/L de ANA fue el que presentó mejores resultados, obtenido 94,7 % de explantes con raíces.  Estos resultados reafirman los logrados por 32, quienes comprobaron que ANA induce porcentajes más altos de enraizamiento que IBA en varias especies del género Citrus. Además, los resultados de nuestro trabajo son similares a los obtenidos por 27 en naranja agria, con casi 95% de explantes enraizados cuando combinaron en el medio de cultivo 1 mg/L de IBA con 1 o 2 mg/L de ANA.
 
Con lo demostrado se puede regenerar plantas de naranja agria a partir de segmentos nodales en condiciones in vitro, de esta manera al tener mayor número de brotes por explante permitirá del mismo modo obtener una mayor tasa de multiplicación. Además de que se logra porcentajes de enraizamiento mayor al 94%, lo cual asegura que las plantas puedan desarrollarse adecuadamente. Con las plantas producidas por este método se pretende recuperar y repoblar la campiña de Huacho al ser una especie de gran importancia en la gastronomía local. Finalmente, también se podrá emplear el germoplasma en condiciones in vitro para programas de mejoramiento genético vegetal.
 
 
CONCLUSIONES

 
Se logró micropropagar in vitro naranja agria a partir de segmentos nodales. Los mejores resultados en la fase de desinfección en los explantes se obtuvieron al emplear 1,5% y 2% de hipoclorito de sodio. En la fase de la multiplicación in vitro los mejores resultados se obtuvieron en el medio de cultivo con 0,25 mg/L de BAP, 0,25 mg/L KIN y 0,25 mg/L de AG3, el cual se recomienda emplear por permitir obtener mayor número de brotes. Y finalmente en la fase de enraizamiento el medio suplementado con 1 mg/L de IBA y 1 mg/L de ANA permitió obtener el mayor porcentaje de explantes enraizados y número de raíces.
 
 
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Recibido: 11 junio 2021
 
Aceptado: 29 septiembre2021
 
 
 
Angel David Hernández-Amasifuen, Alexandra Jherina Pineda-Lázaro *, Hermila Belba Díaz-Pillasca
 
*Autor de correspondencia: Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión, Facultad de Ciencias, Laboratorio de Biotecnología Vegetal, Huacho, Perú, sherina.97.19@gmail.com
 
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