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Latin American Journal of Biotechnology and Life Sciences
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2020.05.03.4
Files > Volume 5 > Vol 5 No 3 2020
INVESTIGATION / RESEARCH
Enriquecimiento proteico de Solanum tuberosum mediante fermentación en estado sólido utilizando Aspergillus niger.
 
Protein enrichment of Solanum tuberosum by solid-state fermentation using Aspergillus niger.

Fonseca Lilibeth Berenize1, Fernández, Danae2, López Orestes Dario.3
Available from: http://dx.doi.org/10.21931/RB/2020.05.03.4

RESUMEN
 
Los residuos de cáscara de papa se han incrementado debido al alto consumo del tubérculo, no obstante, los avances biotecnológicos permiten usar estos desechos y generar otros mejorados generalmente a través de una fermentación con ayuda de microorganismos como Aspergillus niger. En este trabajo se evaluó la influencia del tiempo de fermentación (5 – 8 días), la velocidad de agitación (0 – 60 rpm) y la concentración del inóculo (5000 y 50000 conidios/g de medio) sobre la concentración de biomasa y proteína a través de un diseño factorial 23. El análisis estadístico determinó que los factores con mayor influencia sobre las variables respuestas analizadas fueron la velocidad de agitación y la concentración del inóculo con sus máximos niveles: 60 rpm y 50000 conidios/g de medio respectivamente. Se maximizaron las variables respuestas con valores de 16,31 mg/mL para la concentración de proteína y 0,94 g/mL para la concentración de biomasa.  
 
Palabras clave: Fermentación en estado sólido, Aspergillus niger, enriquecimiento proteico.
 
 
ABSTRACT
 
Potato peel residues have increased due to the high consumption of the tuber; however, biotechnological advances allow us to use these wastes and generate others that are generally improved through fermentation with the help of microorganisms such as Aspergillus niger. In this work, the influence of the fermentation time (5 - 8 days), the stirring speed (0 - 60 rpm) and the concentration of the inoculum (5000 and 50000 conidia / g of medium) on the concentration of biomass and protein were evaluated through a factorial design 23. The statistical analysis determined that the factors with the most significant influence on the analyzed response variables were the stirring speed and the concentration of the inoculum with its maximum levels: 60 rpm and 50000 conidia / g of the medium, respectively. The response variables were maximized with values ​​of 16.31 mg / mL for the protein concentration and 0.94 g / mL for the biomass concentration.
 
Keywords: Solid-state fermentation, Aspergillus niger, protein enrichment.
 

 
 
INTRODUCCIÓN
 
La papa (Solanum tuberosum L) es uno de los tubérculos más frecuentes dentro de la canasta básica ecuatoriana; particularmente la variedad Superchola 1. Su crecimiento es óptimo a una altitud de 2800 a 3600 m2, posee una alta demanda en el mercado y su principal uso radica en la industria alimenticia 3, sin embargo, la acumulación de sus desechos se ha convertido en una problemática 4. La cáscara de la papa es desprendida del tubérculo representando aproximadamente el 2% del volumen total comestible y se acumula a razón de 2 kilogramos por cada 100 kilogramos de papa procesada en el país de Perú 4.
 
Los cultivos en estado sólido se caracterizan por contener el sustrato transformado por el microorganismo en estado sólido y no en solución o suspensión como ocurre en una fermentación líquida 5. El objetivo de la fermentación es el aumento parcial del contenido proteico de los sustratos, mejorando las posibilidades de conservación, cambio de las características físicas y químicas, el color, el olor o el sabor 6. Existen dos tipos de fermentación sólida. El primer tipo es aquel donde el material sólido actúa como principal fuente de nutrientes y como soporte físico del microorganismo al mismo tiempo. El segundo tipo, es en el que el material sólido actúa únicamente como soporte o anclaje del microorganismo y para su cultivo se adiciona una solución nutritiva 7.
 
Aspergillus niger es un hongo que produce un moho negro en vegetales, es muy común en lechuga, tomate, acelga y limón. Es una especie de hongo inocuo para los seres humanos y también para la mayoría de los cultivos 8. La producción de ácido cítrico a gran escala es el principal uso que se le da a este microorganismo, sin embargo, empiezan a desarrollarse nuevas líneas en las que se maximiza la producción de macronutrientes, enzimas y otros metabolitos de amplio interés industrial 9, 10, 11.
 
El objetivo de este estudio fue obtener un incremento proteico en la cáscara de papa mediante fermentación en estado sólido utilizando Aspergillus niger.
 
 
MATERIALES Y MÉTODOS

 
Obtención del sustrato.
 
Se recolectaron los residuos de cáscara de papa (variedad Superchola) y fueron transportados hacia los laboratorios de la Unidad Operativa de la Dirección de Investigación y Desarrollo (UODIDE) radicada en la Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos y Biotecnología de la Universidad Técnica de Ambato.
 
Las cáscaras fueron lavadas con agua potable y cortadas en trozos de 5-7 cm de longitud. Posteriormente, se sometieron a un proceso de secado por aspersión durante 48 horas a una temperatura de 50 °C en un horno de bandejas (GANDER MTN). Se utilizó un molino de cuchilla (Baumgarten Porta Westfalica) para obtener la harina 5.
 
Proceso de fermentación.
 
Se pesaron 150 g de la harina y se sometió a un proceso de esterilización en una autoclave (H1-CLAVE). Se enfrió y se colocó en bandejas a una temperatura de 25 °C, humedad de 60-65% y pH alrededor de 5 a 6. La fermentación se realizó en un agitador orbital (Incu-Shaker mini).
 
Los factores evaluados fueron: la concentración del inóculo (5000 y 50000 conidios/g de medio), tiempo de incubación (5 y 8 días) y la velocidad de agitación (0 y 60 rpm). Las variables respuestas analizadas correspondieron a la concentración de biomasa y concentración de proteína.

 
Determinación de la concentración de biomasa.
 
Para la determinación de la concentración de biomasa se pesaron tres tubos de centrífuga limpios y secos. En la bandeja de fermentación se mezcló la muestra con ayuda de una espátula estéril y se colocó dentro de cada tubo una cantidad equivalente a 5 mL y fueron centrifugados a 4000 rpm durante 10 minutos con una centrífuga (Rotina 380- Hettich Zentrifugen). Se desechó el sobrenadante y se procedió a realizar tres lavados continuos, cada lavado con 2 mL de agua destilada y centrifugados con las condiciones antes mencionadas.
 
Se colocaron los tubos dentro de una estufa (Precision-Thermo Scientific) a 70 °C durante 24 horas para eliminar la humedad. y se registró el valor para realizar los cálculos de biomasa 7. Para estimar la concentración de biomasa se utilizó la Ecuación 1.

 

Determinación de la concentración de proteína.
 
Para la cuantificación de proteína en el medio se tomaron muestras a los 0, 5 y 8 días de fermentación. Se pesó 2 g de éste en una balanza analítica (Adventurer Pro), posteriormente se colocó en un mortero y se añadió 8 ml de solución de NaCl al 1%, se adicionó arena estéril y se trituró. El macerado se colocó en un tubo de centrífuga y se centrifugó a 4000 rpm durante 5 minutos, se recolectó el sobrenadante.
 
Se colocó 0,1 mL del sobrenadante y se añadió 0,9 mL de reactivo Biuret previamente preparado 13. Se realizaron los ensayos por triplicado. Los tubos reposaron durante 20 minutos a temperatura ambiente mientras ocurría la reacción.
 
Finalmente, se leyó la absorbancia de la muestra utilizando el espectrofotómetro UV-vis (accuSkan GO- Fisher Scientific) a una longitud de onda de 540 nm. Se determinó la concentración de proteínas a partir de una curva patrón de albúmina bovina con una concentración en el rango de 5 hasta 20 mg/mL (Figura 1).

 

 
Figura 1. Curva estándar para la determinación de la concentración de proteína.
 

 
Análisis estadístico
 
Para el análisis de los datos se utilizó el software Statgraphics Centurion versión XVI.I con un diseño experimental 23 donde se realizó un análisis de varianza (ANOVA) para determinar si existen diferencias significativas entre los factores estudiados y sus interacciones.
 
Se optimizó los factores: concentración de inóculo, tiempo de fermentación y velocidad de agitación para conocer la mejor relación entre las variables respuestas: concentración de biomasa y proteína. Se consideraron diferencias significativas con un valor-p < 0,05 15.
 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN

 
Análisis de la concentración de biomasa como variable respuesta.
 
Del análisis estadístico total se obtuvo para cada variable respuesta los siguientes indicadores: tabla de análisis de varianza (ANOVA), coeficiente de determinación, diagrama de Pareto estandarizado, gráfico de efectos principales y gráfico de superficie de respuesta.
 
De acuerdo a los resultados obtenidos en la ANOVA para la concentración de biomasa (Tabla 1), el Valor-p de los factores tiempo de fermentación (A), velocidad de agitación (B), concentración de inóculo (C) y la interacción BC fueron inferiores a 0,05, lo que indica que son significativamente diferentes de cero en el nivel de confianza del 95,0%. Según Gutierrez15, una significancia diferente de cero indica que los factores que cumplen con este parámetro influyen significativamente sobre el proceso en análisis.
 


 
Tabla 1. Tabla ANOVA para concentración de biomasa
 
 
El efecto estandarizado se gráfica en el eje x del diagrama de Pareto expresado en valor absoluto. Sirve de estadístico de prueba para aprobar la hipótesis nula contra la alternativa. Así, se rechaza la hipótesis nula si el valor absoluto del efecto estandarizado es mayor que el valor crítico de tablas de la distribución t de Student con los grados de libertad correspondientes al error del análisis 15. Éste último valor se adiciona en el diagrama de Pareto con una línea azul.
 
Para el caso de la concentración de biomasa se puede apreciar que el factor velocidad de agitación (B) seguido del factor concentración de inóculo (C) abarcan la mayor parte de influencia sobre el proceso fermentativo (Figura 2), sin embargo la interacción BC y el tiempo de fermentación (A) también sobrepasan la línea de valor crítico de la tabla de distribución t de Student (Línea vertical de color azul). Por tanto, los estadísticos del diagrama de Pareto corroboran la afirmación que proporcionó la ANOVA al concluir que todos los factores son estadísticamente diferentes de cero.
 


 
Figura 2. Diagrama de Pareto estandarizado para la concentración de biomasa.
 
 
El Gráfico de Efectos Principales (Figura 3) indica una mayor influencia para los factores velocidad de agitación (B) y concentración de inóculo (C) sobre la concentración de biomasa. Se determinó que a medida que aumenta la velocidad de agitación de 0 a 60 rpm y la concentración de inóculo de 5000 a 50000 conidios/g, aumenta la concentración de biomasa; es decir existe una mayor tasa de duplicación celular. El tiempo (A) presenta una línea menos pronunciada al incrementar los días de fermentación, es posible que la influencia de este factor afecte de manera significativa al proceso en un rango más alto o cuando se alcance la máxima taza de duplicación celular 8.
 


 
Figura 3. Gráfico de efectos principales para la concentración de biomasa.
 
 
El análisis de regresión muestra un coeficiente de correlación de 96,4727% lo que indica una relación ajustada a la línea de tendencia de los datos muestréales. Se reportó la ecuación optimizada para la predicción de la concentración de Biomasa en el proceso fermentativo de Aspergillus niger en sustrato de cáscara de papa (Ecuación 2).


 
Análisis de la concentración de proteína como variable respuesta
 
De acuerdo a los resultados obtenidos en la ANOVA para la concentración de proteína (Tabla 2), el Valor-P de los factores tiempo de fermentación (A), velocidad de agitación (B), concentración de inóculo (C) y la interacción AB y AC fueron inferiores a 0,05, lo que indica que son significativamente diferentes de cero en el nivel de confianza del 95,0% por tanto se concluye que los mismos afectan significativamente al proceso fermentativo para los resultados de la concentración de proteína.
 


 
Tabla 2. Tabla ANOVA para la concentración de proteína.
 

El diagrama de Pareto indica que el factor velocidad de agitación (B) seguido del factor tiempo de fermentación (A) abarcan la mayor parte de influencia sobre el proceso fermentativo (Figura 4) El factor cantidad de inóculo (C) y las interacciones AB y AC representan valores menores, pero se consideran significativos debido a que sobrepasan la línea de valor crítico de la tabla de distribución t de Student. Por tanto, los estadísticos del diagrama de Pareto corroboran la afirmación que proporcionó el análisis de varianza al concluir que los factores son estadísticamente diferentes de cero para la variable concentración de proteína.


 
Figura 4. Diagrama de Pareto estandarizada para la concentración de proteína.
 
 

 
Figura 5. Gráfico de efectos principales para la concentración de proteína.
 
 
El Gráfico de Efectos Principales (Figura 5) indica una mayor influencia para los factores velocidad de agitación (B) y tiempo de fermentación (A) sobre la concentración de proteína. Se determina que a medida que aumenta la velocidad de agitación de 0 a 60 rpm y el tiempo de fermentación de 5 a 8 días, aumenta la concentración de proteína. La velocidad de agitación presenta una línea con mayor inclinación. Al parecer la agitación permite que las células obtengan un mejor contacto con la superficie y pueden disponer de mejor manera los nutrientes del medio. De esta manera existe una correlación directamente proporcional entre el sustrato y el crecimiento celular de Aspergillus niger.
 
El tiempo de fermentación influye sobre el crecimiento celular. A mayor división celular mayor síntesis de proteína en el medio, esto se consigue cuando el microorganismo se encuentra en la fase de crecimiento exponencial 10. De tal manera, mientras el conidio se encuentre en la fase exponencial de crecimiento existirá mayor cantidad de biomasa y por ende mayor nivel de proteína sintetizada.
 
El análisis de regresión muestra un coeficiente de correlación de 98,2207% lo que indica una relación ajustada a la línea de tendencia de los datos muestréales. Se reportó la ecuación optimizada para la predicción de la concentración de proteína en el proceso fermentativo de Aspergillus niger en sustrato de cáscara de papa (Ecuación 3)

 

 
Optimización del proceso de fermentación en estado sólido.
 
Para optimizar un proceso es necesario ajustar el modelo de las ecuaciones de regresión lineal a un conjunto de puntos que pertenecen a la región experimental del proceso en análisis. El programa estadístico emite un gráfico que describe el comportamiento de la vibración de estos puntos sobre la región experimental 15. El diagrama toma el nombre de Superficie de Respuesta y describe el comportamiento de la respuesta promedio en cada punto de la región experimental.
 
De las ecuaciones 2 y 3 se obtuvo los diagramas de superficie de respuesta para la optimización de la concentración de biomasa (Figura 6) y la optimización de la concentración de proteína (Figura 7).
 
Se observa que con una concentración de inóculo de 50000 conidios/g, una velocidad de agitación de 60 rpm y un tiempo de fermentación de 8 días es posible alcanzar la deseabilidad más alta (1), por tanto, la optimización de los factores en el proceso fermentativo.
 


 
Figura 6. Superficie de respuesta del modelo ajustado en el proceso fermentativo para optimizar la concentración de biomasa con una concentración de inóculo de 50000 conidios/g de medio.
 


 
Figura 7. Superficie de respuesta del modelo ajustado en el proceso fermentativo para optimizar la concentración de proteína con una velocidad de agitación de 60 rpm.
 
 
Tanto en la Figura 5 como en la Figura 6 se observa una superficie lineal con tendencia a un crecimiento positivo. Este fenómeno explica que aún no se ha alcanzado el nivel máximo de optimización y que los valores críticos de los 3 factores se encuentran por encima de los rangos establecidos en el análisis 15. Sin embargo, se necesita de un estudio con variación de niveles altos y bajos para poder establecer los verdaderos puntos críticos. Si se quiere reproducir los valores obtenidos en este experimento no es recomendable variar los valores de los factores establecidos en este estudio puesto que no se conoce el comportamiento del hongo fuera del rango preestablecido.
 


 
Tabla 3. Valores de las variables respuesta optimizados.
 
 
Los resultados de las variables respuesta optimizadas se resumen en la Tabla 3. Se obtuvo una concentración de biomasa de 0,942 g/mL y una concentración de proteína de 16,31 mg/mL al finalizar el proceso de fermentación. Isique & Sing 16, realizaron estudios sobre la disponibilidad de azúcares reductores y el análisis químico de residuos de cáscara de papa, camote y yuca. Los resultados del análisis químico reportan valores para la concentración de proteína en cáscara de papa de 5,26 g/mL.
 
Borras y colaboradores9, en su estudio de la determinación de la influencia de la temperatura sobre el crecimiento de Aspergillus niger en sustrato de harina de papa logró incrementar el valor proteico de 3,21 a 8,33 g/mL al finalizar la fermentación al mantener una temperatura de crecimiento de 25±3 °C. Por otro lado, Aranda y colaboradores5 lograron obtener un alimento enriquecido proteicamente basado en caña de azúcar a través de una fermentación en estado sólido utilizando una mezcla de bacterias lácticas en simbiosis con hongos como Pleurotus ostreatus y Aspergillus niger, el incremento fue de 4, 18 a 19,43 mg de proteína sobre 100 g de cultivo de cultivo fermentado.
 
Por tanto, el valor de incremento proteico obtenido en esta experimentación se encuentra dentro de los rangos reportados bibliográficamente.

 
CONCLUSIONES
 
Se determinó la influencia de los factores: concentración de inóculo, tiempo de fermentación y velocidad de agitación sobre el proceso fermentativo de Aspergillus niger en sustrato de cáscara de papa mediante un análisis estadístico de diseño factorial 23 indicando que existieron diferencias significativas entre los tres factores con un nivel de confianza p < 0,05.
 
Se observó que a pesar de que todos los factores influyeron significativamente sobre el proceso fermentativo, los que afectaron en mayor proporción fueron la velocidad de agitación (B) y la concentración del inóculo (C).
 
Se optimizó el proceso de fermentación en estado sólido con los siguientes parámetros: velocidad de agitación (60 rpm), concentración de inóculo (50000 conidios) y tiempo de fermentación (8 días) con las cuales se maximizó las variables respuesta obteniendo valores de concentración de proteína de 16,31 mg/mL y una concentración de biomasa de 0,94 g/mL.
 
 
REFERENCIAS
 
1.         INIAP. Programa nacional de raices y tubérculos. Variedades papa en el Ecuador 1, 1–320 (2013).
 
2.         Muñoz, F. & Cruz, L. Manual de cultivo de papa. Manual del cultivo de papa 45 (2009).
 
3.         Villalobos, M., López, M., Rodríguez, P. & Prado, M. Obtención de almidón a partir de los residuos de papa del mercado Abastos. Congr. Interdiscip. Cuerpos Académicos 3, 266–271 (2014).
 
4.         Vargas Corredor, Y. A. & Peréz Pérez, L. I. Aprovechamiento de residuos agroindustriales en el mejoramiento de la calidad del ambiente. Rev. Fac. Ciencias Básicas 14, 1–14 (2018).
 
5.         Aranda, E. M., Georgana, L. E., Salgado, S. & Ramos, J. Elaboración de un alimento basado en caña de azúcar a partir de la fermentación en estado sólido y con diferentes niveles de zeolitas. Rev. Cuba. Cienc. Agrícola 46, 159–164 (2012).
 
6.         Suarez, C. Utilización de la fermentación líquida deLentinula edodes (SHIITAKE), para la producción de metabolitos secundarios bioactivos y evaluación de su potencial empleo en la producción de un alimento funcional. Univ. Nac. Colomb. Programa Interfacultades en Cienc. y Tecnol. Aliment. 2, 1–122 (2012).
 
7.         Moyano, M. A. Fermentacion en estado solido (FES) de la papa (Solanum tuberrosum), como alternativa tecnológica para la alimentación. Univ. Nac. Abierta y a Distancia 3, 1–87 (2014).
 
8.         Reyes, I., González, M. & López, F. Un análisis del metabolismo de Aspergillus niger creciendo sobre un sustrato sólido. Rev. Mex. Ing. Qum. 12, 41–56 (2013).
 
9.         Borras, L. M., Iglesias, A. E. & Moyano, M. A. Efecto de la temperatura y el tiempo sobre los indicadores de la papa (Solanum tuberosum) fermentada en estado sólido. Cienc. Y Agric. 11, 31 (2016).
 
10.       Cujilema, M. C., León, G. & Porro, M. R. Producción de lipasas por fermentación sólida con aspergillus niger: influencia del ph. Rev. Cent. Azúcar 45, 1–9 (2018).
 
11.       Peña, C. B. Evaluación del contenido nutricional y actividad antioxidante en Solanum tuberosum. Rev. Univ. Nac. Colomb. 4, 1–149 (2015).
 
12.       Apunte, D. Obtención de un medio enriquecido en proteínas a partir de residuos de papa (Solanum tuberosum) por fermentación microbiana Trabajo. 1–42 (2019).
 
13.       Argañaraz, Natalia; Hazán, M. Reconocimiento de Proteínas. Minist. Ciencia, Tecnol. e Innovación Product. 3, 1–21 (2017).
 
14.       Ausel, A., Auxt, A. & Sin, P. Comparación de Bacteria , Archaea y EucO / ya. McGRAW-HILL Interamericana (2009).
 
15.       Gutierrez, H. Análisis y Diseño de Experimentos. (Mc GRAW-HILL, 2012).
 
16.       Isique, M. & Sing, J. Influencia de la hidrólisis química en las características fisicoquímicas y funcionales de los residuos industriales de papa, camote y yuca. Univ. Nac. del St. 7, 1–234 (2017).
 
17.       Arnáiz, C., Isac, L. & Lebrato, J. Determinación de la biomasa en procesos biológicos. Grup. Trat. Aguas Residuales. Esc. Univ. Politécnica 2, 1–8 (2000).
 
18.       Mendez, J. Producción de ácido glucónico aplicando cinética de crecimiento microbiano a partir de Aspergillus niger y como medio de cultivo, dulce de atado. Rev. Univ. El Salvador 6, 1–184 (2013).
 
19.       Chanagá, X., Plácido, J., Marín, M. & Yepres, M. D. S. Hongos Nativos con Potencial Degradador de Tintes Industriales en el Valle de Aburrá , Colombia. Rev. Fac. Nac. Agron. Medellín 65, 6811–6821 (2012).
 
 
 
 
Recibido: 10 julio 2020
 
Aceptado: 10 agosto 2020
 
 
 
Fonseca Lilibeth Berenize1, Fernández Danae2, López Orestes Dario.3
 
1 Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos y Biotecnología, Universidad Técnica de Ambato, Ecuador https://orcid.org/0000-0002-9889-7375
 
2 Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos y Biotecnología, Universidad Técnica de Ambato, Ecuador.   https://orcid.org/0000-0002-7530-7467 Autor de correspondencia. da.fernandez@uta.edu.ec
 
3 Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos y Biotecnología, Universidad Técnica de Ambato, Ecuador https://orcid.org/0000-0002-3217-9493
 
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