2023.08.03.5
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Aislamiento y caracterización de cepas nativas de Trichoderma en la provincia de Tungurahua, Ecuador
Isolation and characterization of native strains of Trichoderma in Tungurahua province, Ecuador
Leiva-Mora Michel1*
, Natalys Solis2, Alfredo Jiménez González3 and David Anibal Guerrero Cando2
, Natalys Solis2, Alfredo Jiménez González3 and David Anibal Guerrero Cando2 1* Laboratorio de Biotecnología, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Técnica de Ambato; e-mail: [email protected].
2 Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Técnica de Ambato; e-mail: [email protected]
3 Facultad de Ciencias Naturales y de la Agricultura. Carrera de Ingeniería Forestal. Universidad Estatal del Sur de Manabí. e-mail: [email protected].
2 Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Técnica de Ambato; e-mail: [email protected].
*Correspondence: e-mail: [email protected].; Tel.: +593 0999937691.
Available from: http://dx.doi.org/10.21931/RB/2023.08.03.5
RESUMEN
El presente trabajo tuvo como objetivo aislar y caracterizar cepas de Trichoderma de la provincia de Tungurahua en Ecuador. Se usaron cuatro métodos de aislamiento, siendo el método de diluciones seriadas a partir de muestras de suelo donde mayor cantidad de aislados de Trichoderma se obtuvo. El diámetro de las hifas, diámetro de conidios y longitud de fiálides fueron muy similares entre los cuatro aislados y concuerdan con los informado para este género. Los conidióforos fueron ramificados, apariencia seca, forma de elipsoidal a esférica. Las paredes de los conidios fueron lisas, incoloros a verdes. Las fiálides en forma de botellas se observaron en todos los aislados.
Palabras clave: conidio, colonia, fiálide, hongos, morfología.
ABSTRACT
The present work aimed to isolate and characterize native strains of Trichoderma from Tungurahua, Ecuador. Four methods were used for isolation, the serial dilutions from soil samples being the one that allowed the most significant amount of Trichoderma isolates to be obtained. The diameter of the hyphae, the diameter of the conidia, and the length of the phialides were very similar among the four Trichoderma isolates. The conidiophores were branched with a dry appearance, ellipsoidal to spherical shape. The walls of the conidia were smooth. The conidia were colorless to green. Bottle-shaped phialides were observed in all isolates.
Keywords: conidia, colony, fungi, morphology, phialide.
INTRODUCCIÓN
Trichoderma es un hongo filamentoso de la clase ascomicete, habitante del suelo donde produce numerosos conidios unicelulares1. En los suelos existe una gran diversidad de especies de este género, motivo por el cual muchos aislamientos se realizan a partir de este recurso natural2. Varias especies de Trichoderma aisladas a partir de muestras de suelo tienen aplicaciones en la industria y particularmente en la agricultura3. Desde el punto de vista bioecológico las especies de Trichoderma colonizan a diferentes especies de plantas de interés agrícola y en muchos casos ofrecen efecto protector contra enfermedades4.
Las especies de Trichoderma actúan como hiperparásitos competitivos mediante la producción de metabolitos antifúngicos y enzimas hidrolíticas que provocan daños estructurales de la pared celular, vacuolización, granulación, desintegración del citoplasma y lisis celular de los hongos fitopatógenos que controlan5. En numerosos cultivos el uso de Trichoderma harzianum y Trichoderma viride ha permitido disminuir entre 10 y 13% de incidencia de hongos fitopatógenos del suelo en comparación con la no aplicación de los mismos6.
Varios estudios relacionados con el bicontrol de agentes fitopatógenos del suelo han cifrado sus esperanzas en el uso de cepas nativas recuperadas del suelo7, la rizósfera8 e incluso de la endosfera de las raíces de plantas de interés económico9. En el cultivo de cebolla igualmente para el control de la pudrición blanca de la cebolla se han realizado esfuerzos por aislar cepas de Trichoderma con capacidad bicontroladora10.
En el cultivo de cebolla en Ecuador la pudrición blanca causada por Stromatinia cepivora (Berk.) Whetzel causa severos daños a los productores de la provincia de Tungurahua. El presente trabajo tuvo como objetivo principal aislar mediante cuatro métodos y caracterizar cultural y morfológicamente cepas nativas de Trichoderma en la provincia de Tungurahua, Ecuador.
MATERIALES Y METODOS
Método 1. Inclusión de raíces a partir de plantas sanas
De condiciones de campo se tomaron raíces de plantas sanas que se encontraban cercanas a plantas enfermas. En condiciones de laboratorio se lavaron en agua corriente durante 10 minutos, posteriormente fueron desinfectadas en hipoclorito de sodio al 5 % durante 5 minutos. Luego fueron lavadas 2 veces en agua des ionizada estéril. Posteriormente en condiciones de flujo laminar en un plato metálico de 20 cm de diámetro se seccionaron las raíces con la ayuda de un bisturí estéril en fragmentos de 5 mm. Finalmente dichos fragmentos fueron incluidos mediante aguja de inoculación en el medio de cultivo Agar Rosa Bengala.
Método 2. Cebo utilizando fragmentos de coco
Se tomaron frutos secos de Cocus nucifera L. de la variedad gigante. Los frutos fueron cortados por la mitad y fueron colocados a 5 cm de profundidad en condiciones de campo. Se dejaron durante 21 días y posteriormente fueron colectados y trasladados hacia el laboratorio en una nevera de Pilietilurano que contenía bolsas de hielo. En el laboratorio se colocaron en una bandeja metálica de 5 L y de las porciones con crecimiento verde se tomaron fragmentos de micelio y se transfirieron mediante aguja de inoculación a cajas de Petri que contenían 25 mL del medio de cultivo Agar Rosa Bengala y se incubaron a 25°C.
Método 3. Cebo preparado a partir de arroz cocinado con melaza y harina de pescado
Se colocó 250 g de arroz cocinado sin sal, dos cucharadas de melaza y dos cucharadas de harina de pescado y se cocieron durante 20 minutos. Posteriormente se colocaron 100 g de esta mezcla en el fondo de un recipiente plástico de 500 mL de capacidad y se le colocó como cubierta una Malla de criba fina de plástico (HDPE) extruido de alta calidad de 120 Mesh. Los recipientes fueron colocados en hoyos de 20 cm de profundidad en el suelo.
Método 4. Método de diluciones seriadas a partir de muestras de suelo.
Se pesaron 10 gramos de muestra de suelo en una bolsa de Stomacher, previamente etiquetada, y se mezclaron con 90 mL de agua de triptona al 0,1%. Y se homogeneizó durante 1 a 3 minutos. A partir de la dilución inicial, se prepararon diluciones decimales seriadas, tomando 1 mL de la dilución 10-1 y descargándolo en 9 mL de agua de triptona al 0,1% y así, sucesivamente hasta llegar a la dilución de 10-5. Cada dilución en tubos de ensayo se sometió a una agitación vigorosa mediante un agitador mecánico tipo Vortex.
El contenido de los tubos de ensayo correspondientes a las diluciones a partir de las diluciones de 10-3, 10-4 y 10-5 fue vertido en cajas de Petri que contenían 25 ml del medio de cultivo Agar Rosa Bengala con Cloranfenicol. Posteriormente el exceso de líquido de las cajas de Petri fue decantado y las cajas de Petri se colocaron en incubadora durante 7 días a 25°C. Las colonias con aspectos culturales similares a Trichoderma fueron transferidas a nuevas cajas de Petri que contenían 25 ml del medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA) e incubadas durante 7 días a 25°C.
Para la caracterización morfológica de los aislados se tomaron en cuenta los criterios referidos por Siddiquee (2017)11.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Método 1. Inclusión de raíces a partir de plantas sanas
Con el método de inclusión de raíces en el medio de cultivo Agar Rosa Bengala no se pudo recuperar de las muestras analizadas cepas de Trichoderma. Los géneros de hongos que más prevalecieron con este método fueron Fusarium y Penicillium (figura 1). Estos resultados no coinciden con los informados por Abdelrahman et al., 12 quienes lograron obtener aislados de Trichoderma longibrachiatum a partir de fragmentos de raíces de cebolla sanas, los cuales mostraron actividad antifúngica in vitro frente a Fusarium oxysporum f. sp. cepa.
Figura 1. Colonias de hongos filamentosos de los géneros Fusarium y Penicillium obtenidas mediante el método de inclusión de raíces en medio de cultivo Agar Rosa Bengala a partir de plantas sanas de cebolla.
Método 2. Cebo utilizando fragmentos de coco
Al cabo de los 14 días se observaron numerosas colonias con crecimiento filamentoso y coloraciones que variaron desde el verde claro, verde oscuro, blanco al gris. Cuando se realizaron análisis bajo el microscopio prevaleció el género Penicillium pero no se logró obtener colonias del género Trichoderma (figura 2). En relación con la selectividad del coco para la captura de especies de Penicillium sp. nuestros resultados son similares a los obtenidos por Cortés-Rivera13.
Método 3. Cebo preparado a partir de arroz cocinado con melaza y harina de pescado
Mediante el uso de tarrinas con sustrato de arroz, melaza y harina de pescado se comenzaron a observar la formación de colonias verdes, amarillas y blancas a partir de los 7-10 días. Con el presente método solo se obtuvo un aislado de Trichoderma (P5M1) pues la mayor parte de las tarrinas poseían colonias de Penicillium y Aspergillus que impidieron obtener aislados puros de Trichoderma (figura 2).
Figura 2. Presencia de colonias de hongos filamentos en tarrinas a los 10 días de colocadas en campo. Aislado de Trichoderma (P5M1) obtenido a partir de colonia de color verde oscuro.
Método 4. Método de diluciones seriadas a partir de muestras de suelo.
Con este método se obtuvieron 3 aislados (P10M2, P4M2 y P6M3) de Trichoderma (figura 3).
Figura 3. Colonias de aislados de Trichoderma (P10M2, P4M2 y P6M3) obtenidos mediante método de diluciones seriadas a partir de muestras de suelo y crecidas en el medio de cultivo PDA durante 10 días a 25°C
Nuestros resultados fueron similares a los obtenidos por Cubillos et al. (2014) quienes a partir de sustratos enriquecidos con arroz pudieron aislar exitosamente cepas de Trichoderma14. Asimismo, en algunas cajas de Petri aparecieron otros hongos del género Fusarium, Penicillium y Aspergillus (figura 4).
Figura 4. Otros géneros de hongos que aparecieron en cajas de Petri utilizando el método de aislamiento directo. Colonia de Penicillium (A), Colonia de Fusarium (B) y Colonias de Aspergillus (C).
3.5. Caracterización morfológica de los aislados obtenidos de Trichoderma
En relación con los valores de las variables diámetro de las hifas, diámetro de conidios y longitud de fiálides fueron muy similares entre los cuatro aislados de Trichoderma. Los conidióforos fueron ramificados. Las ramas principales de los conidióforos producen
ramas laterales que pueden estar emparejadas o no, las ramas más largas distantes del extremo las fiálides surgieron directamente del eje principal cerca del extremo. Algunas ramas secundarias cerca del eje principal. Todas las ramas primarias y secundarias surgieron en un ángulo de 90° aproximadamente con respecto al eje principal. El conidióforo típico de Trichoderma forma ramas
apareadas con un aspecto piramidal. Normalmente, los conidióforos terminaron en uno o unos pocas fiálides (figura 5). 
Figura 5. Características de conidióforos, fiálides y conidios de los aislados de Trichoderma obtenidos. A- Aislado P10M2. B- Aislado P4M2. C- Aislado P5M1. D- Aislado P6M3
Estos resultados son similares a los obtenidos por Zhang et al., (2022) quienes refirieron la presencia de conidióforos ramificados irregularmente con estructura dendriforme los cuales terminaban en verticilos cruzados con varias fiálides15.
Los diámetros promedios de las hifas para los aislados fueron: 7,30 µm (P10M2), 7,60 µm (P4M2), 7,28 µm (P5M1) y 7,00 µm (P6M3). Los diámetros promedios de los conidios fueron: 2,90 µm (P10M2), 3,17 µm (P4M2), 2,90 µm (P5M1) y 3,46 µm (P6M3). Finalmente, la longitud promedio de las fiálides fueron: 14,70 µm (P10M2), 15,68 µm (P4M2), 14,50 µm (P5M1) y 13,28 µm (P6M3) (tabla 1). Estos promedios tanto en el diámetro de hifa como de los conidios fueron similares a lo informado por Cuervo-Parra et (2022)16.
Tabla 1. Caracterización morfológica de los aislados obtenidos de Trichoderma
En relación con los conidios en los cuatros aislados de Trichoderma estos mostraron apariencia seca, forma de elipsoidal a esférica, de 3 a 5 x 2 a 4 µm de largo de modo general, aunque cada aislado mostraron dimensiones específicas. Los conidios en sus paredes mostraron superficies lisas. Se observaron conidios incoloros a verdes. Las fiálides en forma de botella, con aspectos de cilíndricas o casi subglobosas, sostenidas en espirales e insertadas en un ángulo de 90°. Respecto a la forma de los conidios estos fueron similares a los decritos por Kamil et al., (2022) aunque los de estos autores prevalecieron las formas elipsoidales17. Por otra parte, en relació
CONCLUSIONES
Con el método de diluciones seriadas a partir de muestras de suelo de la provincia Tungurahua, se lograron aislar con mayor eficiencia cepas nativas del suelo de Trichoderma. Acorde con el diámetro de las hifas, diámetro de conidios y longitud de fiálides observadas, sus características morfológicas fueron similares al género Trichoderma.
Author Contributions: Conceptualización, Michel Leiva Mora y Alfredo Jimenez González; Metodología, Michel Leiva Mora, Yosbel Lazo Roger y Gustavo Daniel Valle Naranjo; software, Michel Leiva Mora y Gustavo Daniel Valle Naranjo, validación, Michel Leiva Mora y Yosbel Lazo Roger, análisis formal, Michel Leiva Mora y Alfredo Jimenez González; investigación, Michel Leiva Mora y Gustavo Daniel Valle Naranjo; recursos, Alfredo Jimenez Gonzále y Michel Leiva Mora, curado de datos, Yosbel Lazo Roger, Michel Leiva Mora; redacción—redacción borrador original, Michel Leiva Mora, Gustavo Daniel Valle Naranjo, Yosbel Lazo Roger; redacción—revisión y edición, Yosbel Lazo Roger, Michel Leiva Mora, Gustavo Daniel Valle Naranjo y Alfredo Jimenez González; supervisión, Michel Leiva Mora; administración del proyecto, Michel Leiva Mora, adquisición del financiamiento, Alfredo Jimenez González y Michel Leiva Mora; Todos los autores han leído y están de acuerdo con la versión publicada del manuscrito.
Agradecimientos: Agradecemos a la Dirección de Investigación y Desarrollo (DIDE) de La Universidad Técnica de Ambato por el financiamiento otorgado al proyecto de investigación de la Facultad de Ciencias Agropecuarias Selección de aislados de Trichoderma spp. con potencial biocontrolador del agente causal de la pudrición blanca de la cebolla con Resolución Nro. UTA-CONIN-2020-0312-R mediante el cual fue posible el desarrollo del presente trabajo.
Conflictos de interés: Los autores manifestamos que no existen conflicto de intereses ni argumentos que invaliden la publicación del manuscrito.
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Received: 28 May 2023/ Accepted: 15 July 2023 / Published:15 September 2023
Citation: Mora Michel L, SolisN, Jiménez González A, Guerrero Cando D A. Aislamiento y caracterización de cepas nativas de Trichoderma en la provincia de Tungurahua, Ecuador. Revis Bionatura 2023;8 (3) 5. http://dx.doi.org/10.21931/RB/2023.08.03.5